| 中文摘要 | 第1-4页 |
| Abstract | 第4-6页 |
| 中文文摘 | 第6-9页 |
| 目录 | 第9-16页 |
| 绪论 | 第16-28页 |
| 1 信号分子的合成 | 第16-19页 |
| ·AHL的合成 | 第16-17页 |
| ·AIP的合成 | 第17-18页 |
| ·AI-2的合成 | 第18-19页 |
| 2 几种革兰氏阴性细菌的群体感应机制 | 第19-24页 |
| ·费氏弧菌(Vibrio fischeri)的群体感应 | 第19-20页 |
| ·铜绿假单胞杆菌(Pseudomonas aeruginosa)的群体感应 | 第20-21页 |
| ·胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)的群体感应 | 第21-22页 |
| ·土壤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的群体感应 | 第22-24页 |
| 3 细菌群体感应的应用 | 第24-25页 |
| ·抑制信号分子的合成 | 第24页 |
| ·降解信号分子 | 第24页 |
| ·抑制信号分子与受体蛋白的结合 | 第24-25页 |
| 4 本课题的研究目的及意义 | 第25-28页 |
| 第一章 重组工程菌E.coli BL21(DE3)-pET29a-aiiA可溶性AiiA蛋白的发酵条件优化 | 第28-38页 |
| 第一节 前言 | 第28页 |
| 第二节 材料和方法 | 第28-30页 |
| ·实验材料 | 第28-29页 |
| ·菌种 | 第28页 |
| ·主要试剂 | 第28页 |
| ·仪器与设备 | 第28-29页 |
| ·实验方法 | 第29-30页 |
| ·单菌落制备 | 第29页 |
| ·一级菌种制备 | 第29页 |
| ·破壁方法 | 第29页 |
| ·SDS-PAGE样品处理 | 第29页 |
| ·检测方法 | 第29页 |
| ·细胞密度的测定 | 第29页 |
| ·蛋白质相对含量测定 | 第29页 |
| ·生长曲线的测定 | 第29页 |
| ·培养基的筛选 | 第29-30页 |
| ·IPTG的优化 | 第30页 |
| ·初始生物量的优化 | 第30页 |
| ·诱导时间的优化 | 第30页 |
| ·装液量的优化 | 第30页 |
| ·pH的优化 | 第30页 |
| ·微量元素的优化 | 第30页 |
| 第三节 结果与分析 | 第30-35页 |
| ·培养基的筛选 | 第30-31页 |
| ·IPTG浓度对AiiA蛋白可溶性表达的影响 | 第31页 |
| ·初始生物量对AiiA蛋白可溶性表达的影响 | 第31-32页 |
| ·诱导时间对AiiA蛋白可溶性表达的影响 | 第32页 |
| ·装液量对AiiA蛋白可溶性表达的影响 | 第32-33页 |
| ·pH对AiiA蛋白可溶性表达的影响 | 第33页 |
| ·微量元素对AiiA蛋白可溶性表达的影响 | 第33-34页 |
| ·工程菌生长曲线 | 第34页 |
| ·优化前后的比较 | 第34-35页 |
| 第四节 小结与讨论 | 第35-38页 |
| 第二章 AiiA酶动力学分析 | 第38-50页 |
| 第一节 前言 | 第38页 |
| 第二节 材料和方法 | 第38-44页 |
| ·材料和方法 | 第38-40页 |
| ·菌种 | 第38页 |
| ·主要试剂 | 第38页 |
| ·缓冲液 | 第38-40页 |
| ·胶再生及纯化溶液 | 第38-39页 |
| ·SDS-PAGE溶液 | 第39页 |
| ·蛋白质浓度测定溶液 | 第39-40页 |
| ·牛血清白蛋白(BSA)标准品 | 第40页 |
| ·仪器与设备 | 第40页 |
| ·实验方法 | 第40-44页 |
| ·单菌落制备 | 第40页 |
| ·一级菌种制备 | 第40页 |
| ·培养及诱导方法 | 第40-41页 |
| ·破壁方法 | 第41页 |
| ·蛋白质纯化 | 第41页 |
| ·镍柱的再生 | 第41页 |
| ·SDS-PAGE样品处理 | 第41-42页 |
| ·细胞密度的测定 | 第42页 |
| ·蛋白质浓度的测定:Bradford法检测蛋白质含量 | 第42页 |
| ·AiiA蛋白酶活力测定 | 第42-43页 |
| ·AiiA蛋白反应进程曲线的测定 | 第43页 |
| ·pH对AiiA酶活力的影响 | 第43页 |
| ·温度对AiiA酶活力的影响 | 第43页 |
| ·AiiA蛋白的热稳定性 | 第43-44页 |
| ·AiiA蛋白4℃储存稳定性 | 第44页 |
| ·AiiA酶动力学参数Km值的确定 | 第44页 |
| 第三节 结果与分析 | 第44-49页 |
| ·AHL标准曲线 | 第44页 |
| ·蛋白质浓度标准曲线 | 第44-45页 |
| ·AiiA蛋白反应进程曲线 | 第45页 |
| ·反应温度对AiiA蛋白酶催化活力的影响 | 第45-46页 |
| ·反应pH对AiiA蛋白酶催化活力的影响 | 第46页 |
| ·AiiA蛋白对热的稳定性 | 第46-47页 |
| ·AiiA蛋白4℃储存稳定性 | 第47页 |
| ·底物AHL的浓度对AiiA蛋白反应初速度的影响 | 第47-48页 |
| ·AiiA蛋白酶促反应的米氏常数和最大反应速度 | 第48-49页 |
| 第四节 小结与讨论 | 第49-50页 |
| 第三章 AiiA蛋白定点突变 | 第50-74页 |
| 第一节 前言 | 第50页 |
| 第二节 材料和方法 | 第50-56页 |
| ·材料 | 第50-52页 |
| ·菌株和质粒 | 第50页 |
| ·主要试剂 | 第50-51页 |
| ·培养基及缓冲液 | 第51页 |
| ·定点突变引物 | 第51-52页 |
| ·主要仪器 | 第52页 |
| ·方法 | 第52-56页 |
| ·质粒的提取 | 第52-53页 |
| ·定点突变引物设计原则 | 第53页 |
| ·定点突变PCR条件的摸索 | 第53-54页 |
| ·制备E.coli BL21(DE3)感受态 | 第54页 |
| ·热击转化 | 第54页 |
| ·用DpnI选择突变体方法 | 第54-55页 |
| ·突变菌株的诱导表达 | 第55页 |
| ·破壁方法及突变蛋白的纯化 | 第55页 |
| ·突变后蛋白酶活的测定 | 第55-56页 |
| ·突变后AiiA的热稳定性 | 第56页 |
| ·温度对突变后AiiA酶活力的影响 | 第56页 |
| ·4℃储存时间对突变后AiiA酶活力的影响 | 第56页 |
| 第三节 结果与分析 | 第56-72页 |
| ·E.coli BL21(DE3)-pET29a-aiiA质粒的提取 | 第56页 |
| ·E.coli BL21(DE3)-pET29a-aiiA的定点突变 | 第56-57页 |
| ·突变质粒的转化和菌落PCR验证 | 第57页 |
| ·突变质粒的质粒PCR验证 | 第57-58页 |
| ·突变质粒的质粒双酶切验证 | 第58页 |
| ·定点突变质粒的测序和分析 | 第58-61页 |
| ·突变菌株与野生菌株酶活力比较 | 第61页 |
| ·E.coli BL21(DE3)-pET29a-aiiA-57-5定点突变 | 第61-63页 |
| ·AiiA-57-5突变点的选择 | 第61-62页 |
| ·AiiA-57-5最适作用温度的研究 | 第62页 |
| ·AiiA-57-5温度稳定性的研究 | 第62-63页 |
| ·AiiA-57-5 4℃储存稳定性的研究 | 第63页 |
| ·E.coli BL21(DE3)-pET29a-aiiA-62-6定点突变 | 第63-65页 |
| ·AiiA-62-6突变点的选择 | 第63-64页 |
| ·AiiA-62-6最适作用温度的研究 | 第64页 |
| ·AiiA-62-6温度稳定性的研究 | 第64-65页 |
| ·AiiA-62-6 4℃储存稳定性的研究 | 第65页 |
| ·E.coli BL21(DE3)-pET29a-aiiA-65-12定点突变 | 第65-67页 |
| ·AiiA-65-12突变点的选择 | 第65-66页 |
| ·AiiA-65-12最适作用温度的研究 | 第66页 |
| ·AiiA-65-12温度稳定性的研究 | 第66-67页 |
| ·AiiA-65-12 4℃储存稳定性的研究 | 第67页 |
| ·E.coli BL21(DE3)-pET29a-aiiA-195-12定点突变 | 第67-70页 |
| ·AiiA-195-12突变位点的选择 | 第67-68页 |
| ·AiiA-195-12最适作用温度的研究 | 第68-69页 |
| ·AiiA-195-12温度稳定性的研究 | 第69页 |
| ·AiiA-195-12 4℃储存稳定性的研究 | 第69-70页 |
| ·E.coli BL21(DE3)-pET29a-aiiA-206-6定点突变 | 第70-72页 |
| ·AiiA-206-6突变位点的选择 | 第70-71页 |
| ·AiiA-206-6最适作用温度的研究 | 第71页 |
| ·AiiA-206-6温度稳定性的研究 | 第71-72页 |
| ·AiiA-206-6 4℃储存稳定性的研究 | 第72页 |
| 第四节 小结与讨论 | 第72-74页 |
| 第四章 工程菌GS115-pPIC9K-aiiA的构建 | 第74-88页 |
| 第一节 前言 | 第74页 |
| 第二节 实验材料和方法 | 第74-82页 |
| ·实验材料 | 第74-77页 |
| ·菌种与质粒 | 第75页 |
| ·主要试剂 | 第75-76页 |
| ·仪器与设备 | 第76-77页 |
| ·实验方法 | 第77-82页 |
| ·引物的设计 | 第77页 |
| ·质粒的提取 | 第77页 |
| ·目的基因的PCR体系 | 第77-78页 |
| ·DNA回收 | 第78页 |
| ·连接反应 | 第78-79页 |
| ·制备JM109感受态细胞 | 第79页 |
| ·热击转化 | 第79页 |
| ·双酶切体系 | 第79页 |
| ·酵母细胞GS115感受态的制备 | 第79页 |
| ·电转法转化酵母细胞 | 第79-80页 |
| ·酵母基因组DNA的提取 | 第80页 |
| ·工程菌GS115-pPIC9K-aiiA的培养及诱导 | 第80页 |
| ·免疫原的制备 | 第80页 |
| ·鼠血清抗体的制备 | 第80-81页 |
| ·血清效价的评定 | 第81页 |
| ·免疫血清的鉴定(western blot) | 第81-82页 |
| 第三节 结果与分析 | 第82-86页 |
| ·目的基因aiiA的获得 | 第82页 |
| ·亚克隆质粒PMD-18T-aiiA的PCR验证 | 第82-83页 |
| ·亚克隆质粒PMD-18T-aiiA的双酶切验证 | 第83页 |
| ·重组表达载体pPIC 9K-aiiA的PCR验证 | 第83-84页 |
| ·重组表达载体pPIC 9K-aiiA的双酶切验证 | 第84-85页 |
| ·重组毕赤酵母工程菌的构建 | 第85页 |
| ·小鼠血清效价的评定 | 第85页 |
| ·免疫血清的鉴定(western blot) | 第85页 |
| ·工程菌GS115-pPIC9K-aiiA的培养及诱导 | 第85-86页 |
| 第四节 小结与讨论 | 第86-88页 |
| 结论 | 第88-90页 |
| 展望 | 第90-92页 |
| 参考文献 | 第92-102页 |
| 致谢 | 第102-104页 |
| 个人简历 | 第104-105页 |
