| 本论文的创新性工作 | 第3-4页 |
| 摘要 | 第4-7页 |
| ABSTRACT | 第7-10页 |
| 英文缩写词汇 | 第11-19页 |
| 第一部分 引言 | 第19-27页 |
| 1 疱疹病毒简介 | 第19页 |
| 2 鸭肠炎病毒研究概况 | 第19-21页 |
| 2.1 鸭肠炎病毒分类 | 第19-20页 |
| 2.2 鸭肠炎病毒毒粒结构 | 第20页 |
| 2.3 鸭肠炎病毒基因组结构 | 第20页 |
| 2.4 鸭肠炎病毒编码蛋白 | 第20-21页 |
| 2.5 鸭肠炎病毒的复制 | 第21页 |
| 3 疱疹病毒保守性蛋白激酶研究进展 | 第21-26页 |
| 3.1 疱疹病毒保守性蛋白激酶简介 | 第21-22页 |
| 3.2 疱疹病毒保守性蛋白激酶功能 | 第22-26页 |
| 3.2.1 自磷酸化及皮层装配 | 第22页 |
| 3.2.2 磷酸化EF-1δ | 第22-23页 |
| 3.2.3 核衣壳出核 | 第23页 |
| 3.2.4 病毒复制 | 第23-24页 |
| 3.2.5 逃避干扰素反应 | 第24-25页 |
| 3.2.6 磷酸化病毒皮层及囊膜蛋白 | 第25-26页 |
| 3.2.7 磷酸化GCV | 第26页 |
| 4 选题目的及意义 | 第26-27页 |
| 第二部分 试验研究 | 第27-171页 |
| 第一章 鸭肠炎病毒CHV株UL13基因生物信息学分析 | 第27-46页 |
| 1 试验材料 | 第27-29页 |
| 1.1 毒株、菌株及载体 | 第27页 |
| 1.2 材料与试剂 | 第27-28页 |
| 1.2.1 试验材料 | 第27页 |
| 1.2.2 试验试剂 | 第27-28页 |
| 1.3 主要试剂的配制 | 第28页 |
| 1.3.1 制备鸭胚成纤维细胞相关溶液 | 第28页 |
| 1.3.2 DNA提取、细菌培养、琼脂糖电泳相关试剂 | 第28页 |
| 1.4 仪器设备 | 第28-29页 |
| 2 试验方法 | 第29-32页 |
| 2.1 鸭肠炎病毒UL13基因克隆 | 第29-31页 |
| 2.1.1 DEV基因组DNA的提取 | 第29页 |
| 2.1.2 PCR扩增鸭肠炎病毒UL13基因 | 第29-30页 |
| 2.1.3 UL13基因的克隆 | 第30-31页 |
| 2.1.4 pET32c-UL13重组质粒鉴定 | 第31页 |
| 2.2 DEV UL13基因核苷酸序列分子特性分析 | 第31-32页 |
| 2.2.1 开放性阅读框搜索及分子特性分析 | 第31页 |
| 2.2.2 DEVUL13基因密码子偏嗜性分析 | 第31-32页 |
| 2.3 DEVUL13基因编码蛋白的分子特性分析 | 第32页 |
| 2.3.1 DEVUL13基因ORF翻译及肽链基本特性分析 | 第32页 |
| 2.3.2 DEVUL13蛋白理化性质分析 | 第32页 |
| 2.3.3 DEVUL13编码蛋白的二级结构预测 | 第32页 |
| 2.3.4 DEVUL13编码蛋白的三级结构预测 | 第32页 |
| 2.3.5 DEVUL13编码蛋白酶活性中心分析 | 第32页 |
| 3 试验结果 | 第32-43页 |
| 3.1 DEVUL13基因分子克隆 | 第33页 |
| 3.2 DEVUL13基因核苷酸序列分子特性分析 | 第33-36页 |
| 3.2.1 开放性阅读框搜索及分子特性分析 | 第33-34页 |
| 3.2.2 DEVUL13基因密码子偏嗜性分析 | 第34-36页 |
| 3.3 DEV UL13基因编码蛋白的分子特性分析 | 第36-43页 |
| 3.3.1 DEVUL13基因ORF翻译及肽链基本特性分析 | 第36-37页 |
| 3.3.2 DEVUL13蛋白理化性质分析 | 第37-41页 |
| 3.3.3 DEVUL13编码蛋白的二级结构预测 | 第41-42页 |
| 3.3.4 DEVUL13编码蛋白的三级结构预测 | 第42页 |
| 3.3.5 DEVUL13编码蛋白与疱疹病毒家族成员各CHPK序列比对 | 第42-43页 |
| 4 讨论 | 第43-46页 |
| 4.1 DEVUL13基因特性分析 | 第43页 |
| 4.2 DEVUL13基因编码蛋白的特性分析 | 第43-46页 |
| 第二章 鸭肠炎病毒UL13基因克隆、原核表达及多克隆抗体制备 | 第46-61页 |
| 1 试验材料 | 第46-47页 |
| 1.1 毒株、菌株及载体 | 第46页 |
| 1.2 材料与试剂 | 第46-47页 |
| 1.2.1 试验材料 | 第46页 |
| 1.2.2 试验试剂 | 第46-47页 |
| 1.3 主要试剂的配制 | 第47页 |
| 1.4 仪器设备 | 第47页 |
| 2 试验方法 | 第47-51页 |
| 2.1 鸭肠炎病毒UL13基因截段克隆、原核表达及纯化 | 第47-50页 |
| 2.1.1 DEVUL13基因截段克隆 | 第47-49页 |
| 2.1.2 DEVUL13截段蛋白诱导表达 | 第49页 |
| 2.1.3 DEVUL13截段蛋白表达条件的优化 | 第49页 |
| 2.1.4 DEVUL13截段重组蛋白的大量制备 | 第49页 |
| 2.1.5 鸭肠炎病毒UL13截段重组蛋白的纯化 | 第49-50页 |
| 2.1.6 鸭肠炎病毒UL13截段重组蛋白的透析复性 | 第50页 |
| 2.2 抗鸭肠炎病毒UL13蛋白多克隆抗体制备 | 第50-51页 |
| 2.2.1 鸭肠炎病毒UL13截段重组蛋白作为抗原免疫动物 | 第50-51页 |
| 2.2.2 DEVUL13多克隆抗体的粗提 | 第51页 |
| 2.2.3 Western-blot分析DEVUL13蛋白的反应原性及所制备血清的特异性 | 第51页 |
| 3 实验结果 | 第51-59页 |
| 3.1 鸭肠炎病毒UL13基因截段克隆、原核表达及纯化 | 第51-57页 |
| 3.1.1 鸭肠炎病毒UL13截段基因的扩增、克隆与鉴定结果 | 第51-53页 |
| 3.1.2 鸭肠炎病毒UL13截段蛋白的原核诱导表达 | 第53-54页 |
| 3.1.3 UL13截段重组蛋白表达条件的优化 | 第54-56页 |
| 3.1.4 鸭肠炎病毒UL13截段蛋白的纯化 | 第56-57页 |
| 3.2 抗鸭肠炎病毒UL13蛋白多克隆抗体制备 | 第57-59页 |
| 3.2.1 兔抗UL13截段重组蛋白多克隆抗体的制备及其免疫原性测定 | 第57-58页 |
| 3.2.2 鸭肠炎病毒UL13截段蛋白与DEV抗血清的反应原性分析 | 第58页 |
| 3.2.3 兔抗鸭肠炎病毒UL13截段蛋白血清特异性分析 | 第58-59页 |
| 4 讨论 | 第59-61页 |
| 4.1 DEVUL13截段重组蛋白原核表达 | 第59-60页 |
| 4.2 DEVUL13截段重组蛋白多克隆抗体的制备 | 第60-61页 |
| 第三章 鸭肠炎病毒UL13基因类型及转录、表达分析 | 第61-75页 |
| 1 试验材料 | 第61-62页 |
| 1.1 毒株、菌株及引物 | 第61页 |
| 1.2 材料与试剂 | 第61-62页 |
| 1.2.1 试验材料 | 第61页 |
| 1.2.2 试验试剂 | 第61-62页 |
| 1.3 主要试剂的配制 | 第62页 |
| 1.4 仪器设备 | 第62页 |
| 2 试验方法 | 第62-66页 |
| 2.1 鸭肠炎病毒UL13基因类型分析 | 第62-64页 |
| 2.1.1 鸭胚成纤维细胞的培养 | 第62页 |
| 2.1.2 药物抑制试验 | 第62-63页 |
| 2.1.3 样品RNA提取和cDNA合成 | 第63页 |
| 2.1.4 样品的检测 | 第63-64页 |
| 2.2 实时荧光定量PCR法(RT-PCR)检测鸭肠炎病毒体外感染宿主细胞UL13基因转录时相分析 | 第64-66页 |
| 2.2.1 实时荧光定量PCR引物特异性检测及PCR反应体系优化 | 第64-65页 |
| 2.2.2 RNA提取和cDNA合成 | 第65页 |
| 2.2.3 样品的定量检测 | 第65页 |
| 2.2.4 统计分析 | 第65-66页 |
| 2.3 WESTERN-BLOT法检测鸭肠炎病毒体外感染宿主细胞UL13蛋白的表达时相分析 | 第66页 |
| 2.3.1 鸭胚成纤维细胞的培养和病毒感染 | 第66页 |
| 2.3.2 DEVUL13蛋白表达时相分析 | 第66页 |
| 3 实验结果 | 第66-72页 |
| 3.1 鸭肠炎病毒UL13基因类型分析 | 第66-68页 |
| 3.1.1 RNA纯度及完整性检测 | 第66-67页 |
| 3.1.2 药物抑制试验判定UL13基因类型 | 第67-68页 |
| 3.2 DEV体外感染DEF细胞中UL13基因转录时相分析 | 第68-72页 |
| 3.2.1 引物特异性检测 | 第68-69页 |
| 3.2.2 标准曲线绘制 | 第69-70页 |
| 3.2.3 UL13基因转录时相分析 | 第70-72页 |
| 3.3 UL13蛋白的表达时相分析 | 第72页 |
| 4 讨论 | 第72-75页 |
| 第四章 鸭肠炎病毒UL13蛋白激酶活性研究 | 第75-119页 |
| 1 试验材料 | 第75-78页 |
| 1.1 毒株、菌株、引物、载体及细胞 | 第75-76页 |
| 1.2 材料与试剂 | 第76-77页 |
| 1.2.1 试验材料 | 第76页 |
| 1.2.2 试验试剂 | 第76-77页 |
| 1.3 主要试剂的配制 | 第77-78页 |
| 1.3.1 重组杆状病毒感染性克隆构建所用试剂 | 第77页 |
| 1.3.2 间接免疫荧光分析(IFA)试验所用试剂 | 第77页 |
| 1.3.3 Red重组及空斑试验相关溶液 | 第77页 |
| 1.3.4 体内磷酸化试验所用试剂 | 第77-78页 |
| 1.4 仪器设备 | 第78页 |
| 2 试验方法 | 第78-91页 |
| 2.1 DEV UL13蛋白激酶体外酶活测定 | 第78-84页 |
| 2.1.1 DEV UL13蛋白体外真核表达及纯化 | 第78-81页 |
| 2.1.2 DEV ΔUL13(K179M)蛋白体外真核表达及纯化 | 第81-82页 |
| 2.1.3 DEV UL13及ΔUL13(K179M)自磷酸化活性测定 | 第82-83页 |
| 2.1.4 DEV UL13蛋白激酶潜在底物的表达与纯化 | 第83页 |
| 2.1.5 DEV UL13及ΔUL13(K179M)蛋白体外磷酸化外源底物活性测定 | 第83-84页 |
| 2.2 DEV UL13及ΔUL13(K179M)蛋白激酶体内酶活测定 | 第84-91页 |
| 2.2.1 DEV CHv-BACΔUL13(K179M)重组毒的构建 | 第84-88页 |
| 2.2.2 CHv-BACΔUL13(K179M)R重组毒的构建 | 第88-89页 |
| 2.2.3 RFLP分析 | 第89页 |
| 2.2.4 重组鸭肠炎病毒CHv-BACΔUL13(K179M)及CHv-BACΔUL13(K179M)R体外细胞培养特性研究 | 第89-90页 |
| 2.2.5 兔抗DEV UL13蛋白激酶潜在底物蛋白抗体的粗提 | 第90页 |
| 2.2.6 重组鸭肠炎病毒UL13蛋白体内激酶活性分析 | 第90-91页 |
| 3 实验结果 | 第91-114页 |
| 3.1 DEV UL13蛋白激酶体外酶活测定 | 第91-105页 |
| 3.1.1 DEV UL13及ΔUL13(K179M)蛋白真核表达体系的构建 | 第91-100页 |
| 3.1.2 DEV UL13蛋白激酶体外酶活测定 | 第100-105页 |
| 3.2 UL13蛋白体内激酶活性分析 | 第105-114页 |
| 3.2.1 DEV CHv-BACΔUL13(K179M)及DEV CHv-BACΔUL13(K179M)R重组毒的构建 | 第105-109页 |
| 3.2.2 RFLP分析 | 第109-110页 |
| 3.2.3 空斑试验 | 第110-111页 |
| 3.2.4 生长曲线分析 | 第111-112页 |
| 3.2.5 体内激酶活性分析 | 第112-114页 |
| 4 讨论 | 第114-119页 |
| 4.1 DEV UL13及DEVΔUL13(K179M)蛋白的真核表达及酶活测定 | 第114-116页 |
| 4.2 DEVCHv-BACΔUL13(K179M)及DEV CHv-BACΔUL13(K179M)R重组毒构建及特性研究 | 第116-119页 |
| 第五章 鸭肠炎病毒UL13基因编码蛋白的定位研究 | 第119-159页 |
| 1 试验材料 | 第119-123页 |
| 1.1 毒株、菌株、引物及载体 | 第119-123页 |
| 1.2 材料与试剂 | 第123页 |
| 1.3 主要试剂的配制 | 第123页 |
| 1.4 仪器设备 | 第123页 |
| 2 试验方法 | 第123-135页 |
| 2.1 DEV UL13蛋白在细胞内的定位及定位信号分析 | 第123-131页 |
| 2.1.1 DEV UL13基因编码蛋白在体外培养的感染细胞中的定位分析 | 第123-124页 |
| 2.1.2 DEV UL13蛋白核定位信号的确定 | 第124-128页 |
| 2.1.3 DEV UL13蛋白入核机制的初探 | 第128-129页 |
| 2.1.4 DEV UL13蛋白核输出信号功能判定 | 第129-131页 |
| 2.2 DEVUL13蛋白入核的功能初探 | 第131-135页 |
| 2.2.1 DEV CHv-BAC UL13-ΔNLS重组毒的构建 | 第131-134页 |
| 2.2.2 RFLP分析 | 第134页 |
| 2.2.3 重组鸭肠炎病毒CHv-BACUL13-ΔNLS体外细胞培养特性研究 | 第134页 |
| 2.2.4 DEV UL13-ANLS蛋白激酶活性分析 | 第134-135页 |
| 3 实验结果 | 第135-155页 |
| 3.1 DEV UL13蛋白在细胞内的定位及定位信号分析 | 第135-147页 |
| 3.1.1 DEV UL13基因编码蛋白在体外培养的感染细胞中的定位分析 | 第135-136页 |
| 3.1.2 DEV UL13蛋白入核信号确定 | 第136-143页 |
| 3.1.3 鸭肠炎病毒UL13蛋白入核机制初步判定 | 第143-145页 |
| 3.1.4 DEV UL13蛋白核输出信号功能判定 | 第145-147页 |
| 3.2 DEV UL13蛋白入核的功能初探 | 第147-155页 |
| 3.2.1 CHv-BAC UL13-ΔNLS重组毒的构建 | 第148-151页 |
| 3.2.2 RFLP分析 | 第151-152页 |
| 3.2.3 DEV CHv-BAC UL13-ANLS体外细胞培养特性分析 | 第152-154页 |
| 3.2.4 UL13-ΔNLS蛋白体内激酶活性探索 | 第154-155页 |
| 4 讨论 | 第155-159页 |
| 4.1 DEV UL13蛋白在细胞内的定位及定位信号分析 | 第155-157页 |
| 4.2 DEV UL13蛋白不入核对病毒生理活动的影响 | 第157-159页 |
| 第六章 鸭肠炎病毒UL13缺失重组毒构建及体外生物学特性研究 | 第159-171页 |
| 1 试验材料 | 第159-160页 |
| 1.1 毒株、菌株、引物 | 第159页 |
| 1.2 材料与试剂 | 第159-160页 |
| 1.3 仪器设备 | 第160页 |
| 2 试验方法 | 第160-161页 |
| 2.1 CHv-BACAUL13-1/ΔUL13-2重组毒的构建 | 第160-161页 |
| 2.1.1 CHv-BACAUL13-1/ΔUL13-2感染性克隆的构建 | 第160页 |
| 2.1.2 CHv-BACAUL13/AUL13-1/ΔUL13-2重组毒的拯救 | 第160-161页 |
| 2.2 RFLP分析 | 第161页 |
| 2.3 重组鸭肠炎病毒CHv-BACΔUL13/ΔUL13-1/ΔUL13-2细胞生物学特性研究 | 第161页 |
| 3 试验结果 | 第161-167页 |
| 3.1 DEV CHv-BACΔUL13-1和DEV CHv-BACΔUL13-2重组毒的构建 | 第161-164页 |
| 3.1.1 CHv-BACΔUL13-1和DEV CHv-BACΔUL13-2感染性克隆的构建 | 第161-163页 |
| 3.1.2 DEV CHv-BACΔUL13、DEV CHv-BACΔUL13-1及DEV CHv-BACΔUL13-2重组毒拯救及鉴定 | 第163-164页 |
| 3.2 RFLP分析 | 第164-165页 |
| 3.3 DEV CHv-BACΔUL13、DEV CHv-BACΔUL13-1及DEV CHv-BACΔUL13-2体外细胞培养特性分析 | 第165-167页 |
| 3.3.1 空斑试验 | 第165-166页 |
| 3.3.2 生长曲线分析 | 第166-167页 |
| 4 讨论 | 第167-171页 |
| 全文总结 | 第171-172页 |
| 参考文献 | 第172-182页 |
| 致谢 | 第182-183页 |
| 作者简介 | 第183页 |
