| 摘要 | 第1-5页 |
| ABSTRACT | 第5-13页 |
| 第一章 绪论 | 第13-31页 |
| ·肝素简介 | 第13-14页 |
| ·肝素合成前体简介 | 第14-15页 |
| ·E. coli K5 及合成 heparosan 关键酶 KfiC 的简介 | 第15-17页 |
| ·低分子肝素及其制备的研究进展 | 第17-25页 |
| ·化学降解法 | 第18-20页 |
| ·亚硝酸解聚法 | 第18页 |
| ·碱解聚法 | 第18-19页 |
| ·氧化解聚法 | 第19页 |
| ·臭氧解聚法 | 第19-20页 |
| ·光化学解聚法 | 第20页 |
| ·物理法 | 第20-21页 |
| ·生物解聚法 | 第21-24页 |
| ·肝素裂解酶 I | 第22页 |
| ·肝素裂解酶 II | 第22页 |
| ·肝素裂解酶 III | 第22-23页 |
| ·其他裂解酶 | 第23-24页 |
| ·合成法 | 第24-25页 |
| ·本文研究的主要内容及创新点 | 第25-26页 |
| ·本文研究的主要内容 | 第25-26页 |
| ·本文创新点 | 第26页 |
| 参考文献 | 第26-31页 |
| 第二章 E. coli K5 合成heparosan关键酶基因kfic的克隆及序列分析 | 第31-48页 |
| ·引言 | 第31页 |
| ·材料和方法 | 第31-40页 |
| ·材料 | 第31-40页 |
| ·菌株和质粒 | 第31-32页 |
| ·培养基与缓冲液 | 第32页 |
| ·主要实验仪器 | 第32-33页 |
| ·工具酶和试剂 | 第33-34页 |
| ·实验方法 | 第34页 |
| ·E. coli K5 基因组 DNA 的提取 | 第34-35页 |
| ·合成 heparosan 关键酶基因 kfic 的 PCR 扩增 | 第35-36页 |
| ·电泳检测 PCR 产物 | 第36-37页 |
| ·合成 heparosan 关键酶基因 kfic 的克隆 | 第37-38页 |
| ·E.coli DH5 感受态细胞的制备 | 第38页 |
| ·转化 E.coli DH5 感受态细胞 | 第38-39页 |
| ·阳性单克隆筛选 | 第39页 |
| ·菌落 PCR | 第39页 |
| ·克隆质粒提取 | 第39-40页 |
| ·目的基因测序及其分析 | 第40页 |
| ·结果与讨论 | 第40-46页 |
| ·目的基因 PCR 扩增 | 第40-41页 |
| ·合成 heparosan 关键酶基因 kfic 的克隆 | 第41-43页 |
| ·合成 heparosan 关键酶基因 kfic 的序列分析 | 第43-46页 |
| ·小结 | 第46-47页 |
| 参考文献 | 第47-48页 |
| 第三章 合成heparosan关键酶基因kfic在E. coli BL21(DE3)中的表达及诱导条件优化 | 第48-62页 |
| ·引言 | 第48-49页 |
| ·材料和方法 | 第49-55页 |
| ·实验菌株和质粒 | 第49页 |
| ·培养基、工具酶及试剂 | 第49-51页 |
| ·实验仪器 | 第51页 |
| ·实验方法 | 第51-55页 |
| ·引物设计 | 第51-52页 |
| ·质粒提取 | 第52页 |
| ·目的基因与表达载体的双酶切 | 第52页 |
| ·重组表达质粒 pET28b-kfic 的构建 | 第52-53页 |
| ·感受态细胞的制备与转化 | 第53页 |
| ·阳性单克隆的筛选 | 第53页 |
| ·重组蛋白的诱导表达 | 第53-54页 |
| ·蛋白的 SDS-PAGE 分析 | 第54-55页 |
| ·结果与讨论 | 第55-60页 |
| ·重组表达质粒的构建 | 第55-56页 |
| ·重组表达质粒的 PCR 鉴定 | 第56-57页 |
| ·重组表达质粒的酶切鉴定 | 第57-58页 |
| ·重组蛋白的表达及其表达条件优化 | 第58-60页 |
| ·诱导剂（IPTG）剂量对重组蛋白表达的影响 | 第58-59页 |
| ·诱导时间对重组蛋白诱导表达的影响 | 第59-60页 |
| ·本章小结 | 第60-61页 |
| 参考文献 | 第61-62页 |
| 第四章 Heparosan不同解聚方法及条件的研究 | 第62-87页 |
| ·前言 | 第62-63页 |
| ·材料与方法 | 第63-66页 |
| ·实验材料 | 第63-64页 |
| ·实验样品 | 第63页 |
| ·实验试剂及其配制 | 第63-64页 |
| ·实验仪器 | 第64页 |
| ·实验方法 | 第64-66页 |
| ·亚硝酸解聚 heparosan 方法 | 第64页 |
| ·H2O2解聚 heparosan 方法 | 第64页 |
| ·肝素酶Ⅱ解聚 heparosan 方法 | 第64页 |
| ·超声波解聚 heparosan 方法 | 第64-65页 |
| ·加入亚硝酸钠的超声波解聚 heparosan 方法 | 第65页 |
| ·电泳样品处理 | 第65页 |
| ·Heparosan 的分离纯化 | 第65页 |
| ·多糖的 PAGE | 第65-66页 |
| ·结果与讨论 | 第66-83页 |
| ·PAGE 的条件优化 | 第66-68页 |
| ·多糖 PAGE 分离胶浓度的选择 | 第66-67页 |
| ·多糖上样量的选择 | 第67-68页 |
| ·肝素酶Ⅱ（HeparinaseⅡ）解聚 heparosan 的研究 | 第68-72页 |
| ·酶解缓冲液对 heparosan 解聚的影响 | 第68-70页 |
| ·Hep II 加入量对 heparosan 解聚的影响 | 第70页 |
| ·酶解反应时间对 heparosan 解聚的影响 | 第70-71页 |
| ·Hep II 酶解 heparosan 产物的1H-NMR 分析 | 第71-72页 |
| ·H2O2解聚 heparosan 的研究 | 第72-77页 |
| ·乙酸浓度对 heparosan 解聚的影响 | 第72页 |
| ·H2O2浓度对 heparosan 解聚的影响 | 第72-73页 |
| ·反应温度对 heparosan 解聚的影响 | 第73-75页 |
| ·反应时间对 heparosan 解聚的影响 | 第75-76页 |
| ·H2O2解聚 heparosan 产物的1H-NMR 分析 | 第76-77页 |
| ·亚硝酸钠解聚 heparosan 的研究 | 第77-81页 |
| ·乙酸浓度对 heparosan 解聚的影响 | 第78页 |
| ·NaNO2浓度对 heparosan 解聚的影响 | 第78-80页 |
| ·反应温度对 heparosan 解聚的影响 | 第80页 |
| ·反应时间对 heparosan 解聚的影响 | 第80-81页 |
| ·超声波法解聚 heparosan 的研究 | 第81-83页 |
| ·超声时间对 heparosan 解聚的影响 | 第81-82页 |
| ·亚硝酸钠对 heparosan 超声波解聚的影响 | 第82-83页 |
| ·本章小结 | 第83-84页 |
| 参考文献 | 第84-87页 |
| 第五章 结论与展望 | 第87-90页 |
| ·结论 | 第87-88页 |
| ·展望 | 第88-90页 |
| 致谢 | 第90-91页 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 | 第91页 |
