| 摘要 | 第1-6页 |
| Abstract | 第6-11页 |
| 第1章 文献综述 | 第11-21页 |
| ·手性物质的重要性及生物催化技术概述 | 第11-14页 |
| ·手性环氧化物及邻位二醇简介 | 第11-13页 |
| ·手性环氧化物及邻位二醇的合成 | 第13-14页 |
| ·化学法 | 第13页 |
| ·生物法 | 第13-14页 |
| ·环氧化物水解酶 | 第14-20页 |
| ·酶的结构和催化机制 | 第14-17页 |
| ·柠檬烯-1,2-环氧化物水解酶家族的结构和催化机制 | 第14-15页 |
| ·α/β-环氧水解酶家族的结构和催化机制 | 第15-17页 |
| ·底物特异性 | 第17-19页 |
| ·大小和形状 | 第17-18页 |
| ·催化动力学 | 第18页 |
| ·区域专一性 | 第18-19页 |
| ·新酶 | 第19-20页 |
| ·探索新的环氧水解酶 | 第19页 |
| ·环氧水解酶催化性能的定向进化 | 第19页 |
| ·催化中心位点的突变 | 第19-20页 |
| ·非催化残基的突变 | 第20页 |
| ·本论文的目的和意义 | 第20-21页 |
| 第2章 绿豆总RNA的提取 | 第21-27页 |
| ·引言 | 第21页 |
| ·材料与方法 | 第21-23页 |
| ·实验材料、仪器与试剂 | 第21-22页 |
| ·材料 | 第21页 |
| ·仪器 | 第21-22页 |
| ·试剂 | 第22页 |
| ·实验方法 | 第22-23页 |
| ·UNIQ-10柱法提取RNA | 第22页 |
| ·Trizol法提取RNA | 第22-23页 |
| ·改良Trizol法提取RNA | 第23页 |
| ·mRNA反转录 | 第23页 |
| ·结果与分析 | 第23-26页 |
| ·RNA样品纯度光谱分析 | 第23-24页 |
| ·RNA样品纯度电泳检测 | 第24-25页 |
| ·GAPDH内参基因PCR检测 | 第25-26页 |
| ·本章小结 | 第26-27页 |
| 第3章 绿豆环氧水解酶的克隆、表达优化 | 第27-47页 |
| ·引言 | 第27页 |
| ·实验与方法 | 第27-36页 |
| ·实验材料 | 第27-29页 |
| ·药品与试剂 | 第27页 |
| ·菌株和质粒 | 第27-28页 |
| ·PCR引物 | 第28页 |
| ·微生物培养基 | 第28-29页 |
| ·缓冲液 | 第29页 |
| ·实验方法 | 第29-36页 |
| ·绿豆环氧水解酶基因ORF框扩增 | 第29-30页 |
| ·cDNA末端快速扩增 | 第30-31页 |
| ·绿豆环氧水解酶RNA全长序列的获取 | 第31-32页 |
| ·菌落PCR | 第32-33页 |
| ·DNA的琼脂糖凝胶电泳 | 第33页 |
| ·DNA产物纯化及DNA电泳胶回收 | 第33页 |
| ·目的片断与载体连接 | 第33-34页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第34页 |
| ·大肠杆菌的钙转化 | 第34页 |
| ·细菌培养及菌种保藏 | 第34页 |
| ·质粒提取 | 第34页 |
| ·目的基因的克隆及测序 | 第34-35页 |
| ·mbEH A的序列分析 | 第35页 |
| ·mbEHA的三维结构模拟和活性中心预测 | 第35页 |
| ·目的蛋白的初步表达 | 第35-36页 |
| ·诱导温度对脂肪酶表达活力的影响 | 第36页 |
| ·IPTG浓度对环氧水解酶表达活力的影响 | 第36页 |
| ·表达产物的SDS-PAGE分析 | 第36页 |
| ·结果与分析 | 第36-46页 |
| ·mbEH A ORF框PCR引物设计 | 第36-37页 |
| ·PCR扩增获得mbEH A基因ORF | 第37页 |
| ·环氧水解酶片段与PMD18-T载体连接 | 第37-38页 |
| ·mbEH A cDNA全长获取 | 第38-40页 |
| ·cDNA末端快速扩增 | 第38-39页 |
| ·mbEH A cDNA全长序列PCR | 第39-40页 |
| ·mbEH A序列分析 | 第40-43页 |
| ·进化树和蛋白比对 | 第40-42页 |
| ·蛋白三维结构及活性中心分析 | 第42-43页 |
| ·重组表达载体pET28a的构建 | 第43-44页 |
| ·绿豆环氧水解酶在大肠杆菌中的表达 | 第44-45页 |
| ·不同诱导温度对环氧水解酶可溶性表达的影响 | 第45-46页 |
| ·IPTG浓度对环氧水解酶表达的影响 | 第46页 |
| ·本章小结 | 第46-47页 |
| 第4章 蛋白纯化及酶学性质研究 | 第47-58页 |
| ·引言 | 第47页 |
| ·实验与方法 | 第47-49页 |
| ·实验材料 | 第47页 |
| ·仪器 | 第47页 |
| ·试剂 | 第47页 |
| ·实验方法 | 第47-49页 |
| ·酶活测定方法 | 第47-48页 |
| ·pET28a-mbEH A重组环氧水解酶的纯化 | 第48页 |
| ·Bradford法定蛋白 | 第48-49页 |
| ·Km值及Vmax值的测定 | 第49页 |
| ·环氧水解酶性质的初步研究 | 第49页 |
| ·HPCL检测环氧水解对映归一性水解 | 第49页 |
| ·结果和分析 | 第49-56页 |
| ·酶活测定方法 | 第49-51页 |
| ·565nm吸光度测定酶活 | 第49-50页 |
| ·570nm吸光度测定酶活 | 第50页 |
| ·280nm吸光度测定酶活 | 第50-51页 |
| ·pET28a-mbEH A重组环氧水解酶的纯化 | 第51-53页 |
| ·硫酸铵沉淀粗酶 | 第51-52页 |
| ·Ni柱亲核层析 | 第52-53页 |
| ·Km值及Vmax值的测定 | 第53页 |
| ·pET28a-mbEH A重组酶的性质研究 | 第53-56页 |
| ·最适温度和温度稳定性 | 第53-54页 |
| ·最适pH和pH稳定性 | 第54页 |
| ·化学试剂对环氧水解酶活力的影响 | 第54-55页 |
| ·酶对有机溶剂的耐受性 | 第55-56页 |
| ·HPLC检测mbEH对pNSO的对映归一性水解 | 第56页 |
| ·本章小结 | 第56-58页 |
| 第5章 重组环氧水解酶冻干条件摸索 | 第58-63页 |
| ·引言 | 第58页 |
| ·材料与方法 | 第58-59页 |
| ·实验材料、仪器与试剂 | 第58页 |
| ·材料 | 第58页 |
| ·仪器与试剂 | 第58页 |
| ·实验方法 | 第58-59页 |
| ·重组mbEH A酶液制备 | 第58页 |
| ·冻干样品制备 | 第58页 |
| ·真空冷冻干燥法制备重组mbEH A粉剂 | 第58页 |
| ·酶活测定 | 第58-59页 |
| ·结果与讨论 | 第59-62页 |
| ·海藻糖对环氧水解酶冻干保护的影响 | 第59页 |
| ·乳糖对环氧水解酶冻干保护的影响 | 第59-60页 |
| ·山梨醇对环氧水解酶冻干保护的影响 | 第60页 |
| ·蔗糖对环氧水解酶冻干保护的影响 | 第60-61页 |
| ·甘露醇对环氧水解酶冻干保护的影响 | 第61页 |
| ·甘氨酸对环氧水解酶冻干保护的影响 | 第61-62页 |
| ·本章小结 | 第62-63页 |
| 第6章 总结与展望 | 第63-65页 |
| ·全文总结 | 第63-64页 |
| ·展望 | 第64-65页 |
| 参考文献 | 第65-72页 |
| 致谢 | 第72-73页 |
| 硕士期间的研究成果 | 第73页 |