| 致谢 | 第1-11页 |
| 中文摘要 | 第11-13页 |
| 英文摘要 | 第13-16页 |
| 第一章 文献综述 | 第16-29页 |
| 1 大熊猫的功能基因 | 第16-17页 |
| 2 Leptin基因 | 第17-23页 |
| ·Leptin的生物学效应 | 第19-21页 |
| ·Leptin与生殖和生长 | 第21-22页 |
| ·Leptin在妊娠和哺乳期的作用 | 第22-23页 |
| ·Leptin与疾病的关系 | 第23页 |
| 3 Ghrelin基因 | 第23-27页 |
| 4 Interleukin-15(IL-15)基因 | 第27-29页 |
| 第二章 大熊猫Leptin、Ghrelin和IL-15基因的克隆 | 第29-49页 |
| 1 引言 | 第29页 |
| 2 材料 | 第29-30页 |
| ·试验材料 | 第29页 |
| ·主要试剂 | 第29-30页 |
| ·主要仪器 | 第30页 |
| 3 方法 | 第30-35页 |
| ·总RNA的提取 | 第30-31页 |
| ·PCR引物的设计 | 第31页 |
| ·RT-PCR扩增基因 | 第31-33页 |
| ·PCR产物回收和pMD18-T载体的连接 | 第33页 |
| ·连接产物转化大肠杆菌 | 第33-34页 |
| ·重组质粒的菌液PCR鉴定 | 第34页 |
| ·重组子的序列测定 | 第34-35页 |
| ·克隆片断的序列分析 | 第35页 |
| ·克隆序列的GenBank登录 | 第35页 |
| ·Ghrelin mRNA的组织分布 | 第35页 |
| ·Leptin和IL-15蛋白分子结构预测 | 第35页 |
| 4 结果 | 第35-46页 |
| ·总RNA的提取 | 第35-36页 |
| ·Leptin、Ghrelin和IL-15的RT-PCR扩增 | 第36页 |
| ·菌液PCR鉴定 | 第36-37页 |
| ·序列测定 | 第37-41页 |
| ·Ghrelin基因的序列 | 第38-39页 |
| ·Leptin基因的序列 | 第39-40页 |
| ·Interleukin-15基因的序列 | 第40-41页 |
| ·序列同源性比较分析 | 第41-44页 |
| ·Ghrelin mRNA的组织分布 | 第44-45页 |
| ·Leptin和IL-15蛋白分子结构预测 | 第45-46页 |
| 5 讨论 | 第46-49页 |
| 第三章 大熊猫Leptin和IL-15基因的原核表达 | 第49-60页 |
| 1 引言 | 第49页 |
| 2 材料 | 第49-50页 |
| ·试验材料 | 第49页 |
| ·主要试剂 | 第49-50页 |
| ·主要仪器 | 第50页 |
| 3 方法 | 第50-54页 |
| ·原核表达载体的构建 | 第50-51页 |
| ·转化BL21(DE3)及诱导表达 | 第51-52页 |
| ·表达产物的SDS-PAGE电泳检测 | 第52-53页 |
| ·Western blotting | 第53-54页 |
| ·表达蛋白的分离纯化 | 第54页 |
| 4 结果 | 第54-58页 |
| ·Leptin的原核表达 | 第54-57页 |
| ·Leptin表达载体的构建 | 第54-55页 |
| ·Leptin表达产物的SDS-PAGE电泳检测 | 第55-56页 |
| ·Leptin蛋白的Western blotting分析 | 第56页 |
| ·Leptin表达蛋白的分离纯化 | 第56-57页 |
| ·IL-15的原核表达 | 第57-58页 |
| ·IL-15表达载体的构建 | 第57页 |
| ·IL-15表达产物的SDS-PAGE电泳检测 | 第57-58页 |
| ·IL-15蛋白的Western blotting检测 | 第58页 |
| ·IL-15表达蛋白的分离纯化 | 第58页 |
| 5 讨论 | 第58-60页 |
| 第四章 大熊猫生长素AmGH、Leptin和IL-15基因的真核表达 | 第60-79页 |
| 1 引言 | 第60页 |
| 2 材料 | 第60-61页 |
| ·试验材料 | 第60页 |
| ·主要试剂 | 第60-61页 |
| ·主要仪器 | 第61页 |
| 3 方法 | 第61-69页 |
| ·真核表达载体的构建 | 第61-63页 |
| ·引物设计 | 第61-62页 |
| ·PCR反应 | 第62页 |
| ·pPIC9质粒和扩增产物的双酶切及酶切产物连接和转化 | 第62页 |
| ·pPIC9K表达载体的构建 | 第62-63页 |
| ·酵母菌株GS115的分离纯化 | 第63页 |
| ·酵母GS115感受态细胞的制备 | 第63-64页 |
| ·重组质粒线性化 | 第64页 |
| ·重组质粒转化感受态GS115细胞 | 第64-65页 |
| ·含多拷贝重组质粒菌株的筛选 | 第65页 |
| ·Mut+和Muts表型筛选 | 第65页 |
| ·毕赤酵母基因组提取方法 | 第65-66页 |
| ·重组酵母的PCR鉴定 | 第66页 |
| ·Mut+表型重组酵母的诱导表达实验 | 第66页 |
| ·Muts表型重组酵母的诱导表达实验 | 第66-67页 |
| ·DOC-TCA浓缩沉淀表达蛋白 | 第67-68页 |
| ·表达蛋白的SDS-PAGE电泳分析 | 第68页 |
| ·GH表达蛋白的质谱鉴定和表达蛋白的Western blotting鉴定 | 第68页 |
| ·蛋白质的纯化 | 第68-69页 |
| ·硫酸铵分级沉淀纯化AmGH蛋白 | 第68页 |
| ·亲和层析纯化Leptin和IL15蛋白 | 第68-69页 |
| ·AmGH表达条件优化 | 第69页 |
| 4 结果 | 第69-77页 |
| ·大熊猫生长素GH的真核表达 | 第69-74页 |
| ·重组质粒及重组酵母鉴定 | 第69-70页 |
| ·AmGH表达产物的SDS-PAGE电泳检测 | 第70页 |
| ·AmGH的质谱鉴定和Western blotting检测 | 第70-71页 |
| ·AmGH表达的条件优化 | 第71-73页 |
| ·AmGH蛋白的纯化 | 第73-74页 |
| ·Leptin基因的真核表达 | 第74-76页 |
| ·重组质粒及重组酵母鉴定 | 第74-75页 |
| ·Leptin表达产物的SDS-PAGE电泳检测 | 第75页 |
| ·Western blotting | 第75-76页 |
| ·Leptin表达蛋白的纯化 | 第76页 |
| ·Interleukin 15基因的真核表达 | 第76-77页 |
| ·重组质粒及重组酵母鉴定 | 第76页 |
| ·IL-15表达产物的SDS-PAGE电泳检测 | 第76-77页 |
| ·Western blotting | 第77页 |
| 5 讨论 | 第77-79页 |
| 第五章 胃和脾脏全长cDNA文库的构建 | 第79-95页 |
| 1 引言 | 第79-84页 |
| ·cDNA文库构建的原理 | 第79-80页 |
| ·均一化cDNA文库 | 第80-81页 |
| ·差减cDNA文库 | 第81页 |
| ·全长cDNA文库 | 第81-82页 |
| ·SMART法构建全长cDNA文库 | 第82-84页 |
| 2 材料 | 第84页 |
| ·试验材料 | 第84页 |
| ·主要试剂 | 第84页 |
| 3 方法 | 第84-91页 |
| ·总RNA提取和mRNA分离 | 第84页 |
| ·单链和双链cDNA合成 | 第84-86页 |
| ·ds cDNA的酶切和分级 | 第86页 |
| ·cDNA与载体的连接和包装 | 第86-87页 |
| ·文库滴定、重组率测定和文库的扩增 | 第87-90页 |
| ·文库克隆测序 | 第90-91页 |
| 4 结果 | 第91-93页 |
| ·总RNA提取和mRNA分离 | 第91-92页 |
| ·双链cDNA的合成和cDNA分级 | 第92页 |
| ·初级文库的滴度和重组率 | 第92-93页 |
| ·扩增文库的滴度 | 第93页 |
| ·文库克隆测序 | 第93页 |
| 5 讨论 | 第93-95页 |
| 第六章 本研究的主要结论和创新及后续工作 | 第95-98页 |
| ·本文的主要结论 | 第95-96页 |
| ·本文的创新点 | 第96页 |
| ·后续工作建议 | 第96-98页 |
| 参考文献 | 第98-110页 |
| 附录 | 第110-115页 |
| 作者简历 | 第115页 |
