| 摘要 | 第1-4页 |
| Abstract | 第4-8页 |
| 第一章 绪论 | 第8-14页 |
| ·β干扰素与人血清白蛋白融合蛋白 | 第8-9页 |
| ·β干扰素概况 | 第8页 |
| ·β干扰素与人血清白蛋白融合蛋白(IFNβ-HSA) | 第8-9页 |
| ·毕赤酵母表达系统 | 第9-11页 |
| ·毕赤酵母概况 | 第9-10页 |
| ·毕赤酵母表达载体 | 第10页 |
| ·提高外源蛋白表达的策略 | 第10-11页 |
| ·提高酵母分泌外源蛋白的效率 | 第11-13页 |
| ·酵母蛋白分泌途径 | 第11页 |
| ·分子伴侣 | 第11-12页 |
| ·蛋白质二硫键异构酶(PDI) | 第12-13页 |
| ·立题背景及研究内容 | 第13-14页 |
| ·立题背景及目的 | 第13页 |
| ·研究内容 | 第13-14页 |
| 第二章 PDI 基因的克隆及表达载体pPICZαA-PDI 的构建 | 第14-24页 |
| ·材料 | 第14-15页 |
| ·菌种、质粒 | 第14页 |
| ·培养基 | 第14-15页 |
| ·工具酶 | 第15页 |
| ·试剂 | 第15页 |
| ·主要仪器 | 第15页 |
| ·方法 | 第15-20页 |
| ·酵母基因组DNA 的提取 | 第15-16页 |
| ·PDI 基因的PCR 扩增 | 第16页 |
| ·PCR 扩增的PDI 基因片段的割胶纯化 | 第16页 |
| ·重组质粒pMD19T-PDI 的构建 | 第16-18页 |
| ·重组质粒pMD19T-PDI 的提取 | 第18页 |
| ·重组质粒pMD19T-PDI 的鉴定 | 第18-19页 |
| ·重组质粒pMD19T-PDI 的序列测定 | 第19页 |
| ·表达载体pPICZαA-PDI 的构建 | 第19页 |
| ·表达载体pPICZαA-PDI 的鉴定 | 第19-20页 |
| ·结果 | 第20-23页 |
| ·PDI 基因的PCR 扩增 | 第20页 |
| ·重组质粒pMD19T-PDI 的构建及鉴定 | 第20-21页 |
| ·重组质粒pMD19T-PDI 的序列测定 | 第21-22页 |
| ·表达载体pPICZαA-PDI 的构建 | 第22页 |
| ·表达载体pPICZαA-PDI 的鉴定 | 第22-23页 |
| ·讨论 | 第23页 |
| ·小结 | 第23-24页 |
| 第三章 双重重组毕赤酵母工程菌的构建及PDI 对IFNβ-HSA 产量影响 | 第24-34页 |
| ·材料 | 第24-25页 |
| ·菌株与质粒 | 第24页 |
| ·培养基 | 第24页 |
| ·工具酶，抗体与试剂 | 第24-25页 |
| ·主要仪器 | 第25页 |
| ·方法 | 第25-29页 |
| ·线性化表达载体pPICZαA-PDI 片段的制备 | 第25-26页 |
| ·毕赤酵母KM71/pPIC9K-IFNβ-HSA 感受态细胞的制备 | 第26页 |
| ·毕赤酵母KM71/pPIC9K-IFNβ-HSA 感受态细胞的转化 | 第26页 |
| ·毕赤酵母的基因组DNA 的提取 | 第26页 |
| ·重组毕赤酵母的PCR 鉴定 | 第26-27页 |
| ·高拷贝重组子筛选 | 第27页 |
| ·高表达PDI 双重毕赤酵母重组子的筛选 | 第27-28页 |
| ·SDS-PAGE 电泳检测蛋白质表达 | 第28页 |
| ·融合蛋白IFNβ-HSA 含量测定 | 第28-29页 |
| ·结果 | 第29-32页 |
| ·双重重组毕赤酵母的构建及筛选 | 第29页 |
| ·双重重组毕赤酵母鉴定 | 第29-30页 |
| ·高表达PDI 双重重组毕赤酵母的筛选 | 第30-31页 |
| ·融合蛋白IFNβ-HSA 的含量检测 | 第31-32页 |
| ·讨论 | 第32页 |
| ·小结 | 第32-34页 |
| 第四章 融合蛋白IFNβ-HSA 酶联免疫分析方法的优化 | 第34-47页 |
| ·材料 | 第34-35页 |
| ·主要材料与试剂 | 第34页 |
| ·主要仪器 | 第34-35页 |
| ·缓冲液 | 第35页 |
| ·方法 | 第35-38页 |
| ·自制融合蛋白标准品的定量分析 | 第35页 |
| ·双抗夹心法ELISA 基本操作步骤 | 第35-36页 |
| ·样品稀释缓冲液的选择 | 第36页 |
| ·样品孵育时间的优化 | 第36页 |
| ·酶标抗体孵育时间的优化 | 第36页 |
| ·包被及酶标抗体工作浓度的选择 | 第36-37页 |
| ·双抗夹心ELISA 标准曲线的制作 | 第37页 |
| ·双抗夹心ELISA 检测IFNβ-HSA 方法的考核 | 第37-38页 |
| ·结果 | 第38-46页 |
| ·融合蛋白标准品的定量分析 | 第38页 |
| ·样品稀释缓冲液的选择 | 第38-39页 |
| ·样品孵育时间的优化 | 第39页 |
| ·酶标抗体孵育时间的优化 | 第39-40页 |
| ·包被及酶标抗体工作浓度的选择 | 第40-41页 |
| ·标准曲线的绘制 | 第41-42页 |
| ·双抗夹心ELISA 检测IFNβ-HSA 方法学考核 | 第42-46页 |
| ·讨论 | 第46页 |
| ·小结 | 第46-47页 |
| 第五章 结论与展望 | 第47-48页 |
| ·结论 | 第47页 |
| ·展望 | 第47-48页 |
| 致谢 | 第48-49页 |
| 参考文献 | 第49-53页 |
| 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文 | 第53页 |
