| 摘要 | 第5-7页 |
| ABSTRACT | 第7-8页 |
| 第1章 绪论 | 第13-39页 |
| 1.1 线粒体的表观遗传研究 | 第13-23页 |
| 1.1.1 线粒体 | 第13页 |
| 1.1.2 线粒体转录机器 | 第13-20页 |
| 1.1.2.1 线粒体RNA聚合酶 | 第14-16页 |
| 1.1.2.2 线粒体转录因子A | 第16-17页 |
| 1.1.2.3 线粒体转录因子B1和B2 | 第17-18页 |
| 1.1.2.4 人源线粒体DNA启动子转录起始机制 | 第18-20页 |
| 1.1.3 线粒体翻译 | 第20-22页 |
| 1.1.3.1 线粒体核糖体 | 第20页 |
| 1.1.3.2 双功能蛋白质TFB1M和TFB2M对于核糖体产生和翻译的调控 | 第20-21页 |
| 1.1.3.3 线粒体通过mtRNA聚合酶的ATD将转录和翻译耦联 | 第21-22页 |
| 1.1.4 线粒体疾病 | 第22-23页 |
| 1.2 线粒体中的RNA转录后修饰 | 第23-31页 |
| 1.2.1 引言 | 第23-24页 |
| 1.2.2 线粒体核糖体RNA修饰 | 第24-30页 |
| 1.2.2.1 核糖体小亚基的RNA修饰 | 第26-27页 |
| 1.2.2.2 核糖体大亚基的RNA修饰 | 第27-29页 |
| 1.2.2.3 核糖体RNA修饰在发育和疾病中的作用 | 第29-30页 |
| 1.2.3 线粒体转运RNA修饰 | 第30-31页 |
| 1.2.4 线粒体信使RNA修饰 | 第31页 |
| 1.3 m~6A修饰和m_2~6A修饰 | 第31-36页 |
| 1.3.1 mRNA和长链非编码RNA上广泛存在的m~6A修饰 | 第31-33页 |
| 1.3.2 m_2~6A修饰 | 第33页 |
| 1.3.3 哺乳动物中的m~6A编写器 | 第33-34页 |
| 1.3.4 哺乳动物中的m~6A擦除器 | 第34-35页 |
| 1.3.5 哺乳动物中的m~6A识别器 | 第35页 |
| 1.3.6 TFB1M与m_2~6A修饰 | 第35-36页 |
| 1.4 该领域亟待解决的科学问题 | 第36-39页 |
| 第2章 实验材料与实验方法 | 第39-63页 |
| 2.1 人源TFB1M基因的克隆 | 第39-45页 |
| 2.1.1 人源TFB1M表达边界的选择 | 第39页 |
| 2.1.2 引物设计及PCR扩增 | 第39-41页 |
| 2.1.3 琼脂糖凝胶电泳分离目的条带 | 第41页 |
| 2.1.4 TFB1M目的基因条带回收 | 第41页 |
| 2.1.5 质粒抽提 | 第41-42页 |
| 2.1.6 目的基因片段与质粒的双酶切反应 | 第42-43页 |
| 2.1.7 酶切产物回收 | 第43页 |
| 2.1.8 目的基因片段与载体连接反应 | 第43-44页 |
| 2.1.9 连接产物转化至大肠杆菌 | 第44页 |
| 2.1.10 定点突变体的构建 | 第44-45页 |
| 2.2 TFB1M蛋白质的表达和纯化 | 第45-46页 |
| 2.2.1 TFB1M蛋白质的表达 | 第45页 |
| 2.2.2 TFB1M蛋白质的Ni~(2+)柱亲和层析纯化 | 第45-46页 |
| 2.2.3 TFB1M蛋白质的凝胶过滤层析 | 第46页 |
| 2.2.4 TFB1M蛋白质透析酶切及反过镍柱 | 第46页 |
| 2.3 helix45 RNA的体外转录 | 第46-52页 |
| 2.3.1 RNA引物设计 | 第46-47页 |
| 2.3.2 T7RNA聚合酶的表达纯化 | 第47-48页 |
| 2.3.3 小规模转录优化镁离子浓度及模板浓度 | 第48-49页 |
| 2.3.4 PAGE胶鉴定RNA转录效果 | 第49-50页 |
| 2.3.5 RNA的大规模体外转录和纯化 | 第50-52页 |
| 2.4 蛋白质和RNA复合物晶体筛选及数据解析 | 第52-54页 |
| 2.4.1 晶体样品准备 | 第52-53页 |
| 2.4.2 晶体初筛、数据收集及结构测定 | 第53-54页 |
| 2.5 凝胶电泳迁移实验 | 第54-56页 |
| 2.5.1 凝胶电泳迁移实验原理 | 第54-55页 |
| 2.5.2 凝胶电泳迁移实验方法 | 第55-56页 |
| 2.6 同位素标记方法测定甲基转移酶酶活性实验 | 第56页 |
| 2.7 GST pull-down实验 | 第56-58页 |
| 2.7.1 带有GST-tag的蛋白质纯化 | 第57页 |
| 2.7.2 肝癌细胞PLC中拉取与TFB1M蛋白质相互作用的复合物 | 第57-58页 |
| 2.8 引物延伸方法测定酶活性 | 第58-60页 |
| 2.8.1 引物延伸方法原理 | 第58页 |
| 2.8.2 引物延伸实验方法 | 第58-60页 |
| 2.9 RNA核磁共振波谱实验 | 第60-63页 |
| 2.9.1 核磁样品准备 | 第60页 |
| 2.9.2 核磁谱仪实验设置 | 第60-61页 |
| 2.9.3 核磁共振波谱实验参数设置 | 第61-63页 |
| 第3章 人源TFB1M蛋白质与helix45 RNA复合物的结构与功能研究 | 第63-85页 |
| 3.1 人源TFB1M与helix45复合物结构与功能研究结果 | 第63-85页 |
| 3.1.1 引言 | 第63页 |
| 3.1.2 人源TFB1M蛋白质的边界选择 | 第63页 |
| 3.1.3 人源TFB1M蛋白质的表达和纯化 | 第63-64页 |
| 3.1.4 人源helix45 RNA的体外转录及纯化 | 第64-66页 |
| 3.1.5 人源TFB1M蛋白质和helix45的相互作用分析 | 第66页 |
| 3.1.6 人源TFB1M和helix45的二元复合物及加入底物SAM的三元复合物晶体结构 | 第66-69页 |
| 3.1.7 hsTFB1M的折叠模式同m~6ArRNA的腺嘌呤甲基转移酶类似 | 第69-73页 |
| 3.1.8 复合物TFB1M-h45-SAM结构中h45的折叠模式不同于原核生物KsgA-RNA-SAH | 第73-74页 |
| 3.1.9 在修饰的初始状态,TFB1M能够优先选择识别m937A位点 | 第74-75页 |
| 3.1.10 m. 934G锚定在蛋白质TFB1M的小口袋中 | 第75页 |
| 3.1.11 TFB1M与h45之间的结合主要依赖于静电相互作用 | 第75-78页 |
| 3.1.12 蛋白质的酶活中心突变或破坏其与底物的结合会阻碍修饰过程 | 第78-79页 |
| 3.1.13 TFB1M缺陷会导致线粒体AIP产量降低,并抑制线粒体蛋白质的表达 | 第79-85页 |
| 第4章 人源helix45 RNA的核磁结构研 | 第85-105页 |
| 4.1 人源helix45的结构设计 | 第85页 |
| 4.2 非修饰h45的核磁结构解析 | 第85-100页 |
| 4.2.1 h45的一维氢谱检测 | 第85-86页 |
| 4.2.2 h45的亚氨基和氨基的化学位移指认 | 第86-89页 |
| 4.2.3 H8/H6和H5的化学位移指认 | 第89-90页 |
| 4.2.4 H1'与H8/H6的串谱 | 第90-91页 |
| 4.2.5 糖环上其他氢原子的化学位移指认 | 第91-92页 |
| 4.2.6 核磁结构计算中约束文件的产生 | 第92-98页 |
| 4.2.7 核磁结构的初步计算及修正 | 第98-99页 |
| 4.2.8 非修饰h45的溶液结构形成一个稳定的A-form茎环 | 第99-100页 |
| 4.3 双甲基化修饰RNA m_2~6A- h45的核磁结构解析 | 第100-105页 |
| 4.3.1 双甲基化修饰m_2~6A-h45的核磁谱图指认 | 第100-101页 |
| 4.3.2 m_2~6A-h45的约束文件产生 | 第101-102页 |
| 4.3.3 m_2~6A-h45的核磁结构计算和修正 | 第102页 |
| 4.3.4 m_2~6A-h45的核磁结构与非修饰h45的结构类似 | 第102-105页 |
| 第5章 讨论、总结与展望 | 第105-113页 |
| 5.1 讨论 | 第105-109页 |
| 5.1.1 体内h45的双甲基化修饰会影响线粒体中蛋白质的翻译 | 第105-106页 |
| 5.1.2 真核生物中TFB1M和TFB2M的酶活区域差异可能导致了其功能的偏好性不同 | 第106-107页 |
| 5.1.3 催化初始状态中m 937A的位置优先选择为双甲基化修饰机理提供了新思路 | 第107-108页 |
| 5.1.4 真核生物线粒体内TFB1M在催化h45时可能需要复合物的参与 | 第108页 |
| 5.1.5 h45和m_2~6A-h45之间的“GGAA”构象变化依赖于TFB1M的结合 | 第108-109页 |
| 5.2 总结 | 第109-110页 |
| 5.3 展望 | 第110-113页 |
| 附录 | 第113-129页 |
| 参考文献 | 第129-139页 |
| 致谢 | 第139-141页 |
| 在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果 | 第141页 |
