| 摘要 | 第4-5页 |
| abstract | 第5-6页 |
| 第1章 引言 | 第12-20页 |
| 1.1 α-L-鼠李糖苷酶 | 第12-14页 |
| 1.1.1 α-L-鼠李糖苷酶的空间结构分析 | 第12-13页 |
| 1.1.2 α-L-鼠李糖苷酶的作用机制 | 第13页 |
| 1.1.3 α-L-鼠李糖苷酶的来源及其理化性质 | 第13页 |
| 1.1.4 α-L-鼠李糖苷酶的应用 | 第13-14页 |
| 1.2 酶工程技术之定向进化 | 第14-17页 |
| 1.2.1 半理性设计 | 第14-16页 |
| 1.2.2 理性设计 | 第16-17页 |
| 1.3 蛋白质同源建模 | 第17-18页 |
| 1.3.1 同源建模步骤 | 第18页 |
| 1.3.2 同源建模软件 | 第18页 |
| 1.4 本论文的研究背景及意义 | 第18-19页 |
| 1.5 本论文的研究内容 | 第19-20页 |
| 1.5.1 α-L-鼠李糖苷酶突变库的构建及筛选 | 第19页 |
| 1.5.2 α-L-鼠李糖苷酶二级结构的预测及三级结构的建模 | 第19页 |
| 1.5.3 热稳定提高突变体定点突变的研究 | 第19页 |
| 1.5.4 WT及突变体酶学性质及应用的研究 | 第19-20页 |
| 第2章 α-L-鼠李糖苷酶突变库的构建及筛选 | 第20-34页 |
| 2.1 试验材料及仪器 | 第20-22页 |
| 2.1.1 菌株及载体 | 第20页 |
| 2.1.2 主要仪器 | 第20-21页 |
| 2.1.3 主要试剂 | 第21页 |
| 2.1.4 培养基 | 第21-22页 |
| 2.2 实验方法 | 第22-28页 |
| 2.2.1 突变α-L-鼠李糖苷酶基因的获得 | 第22页 |
| 2.2.2 易错PCR | 第22-23页 |
| 2.2.3 突变率的测定 | 第23页 |
| 2.2.4 突变α-L-鼠李糖苷酶基因pPIC9K表达载体的构建 | 第23页 |
| 2.2.5 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备 | 第23-24页 |
| 2.2.6 双酶切后pPIC9K及易错PCR产物的连接 | 第24页 |
| 2.2.7 pPIC9K与易错产物的转化 | 第24页 |
| 2.2.8 重组质粒的鉴定 | 第24页 |
| 2.2.9 重组质粒pPIC9K-rhaep的电击转化 | 第24页 |
| 2.2.10 毕赤酵母GS115感受态细胞的制备 | 第24-25页 |
| 2.2.11 电转化 | 第25页 |
| 2.2.12 pPIC9K-rhaep/GS115阳性克隆的筛选 | 第25-26页 |
| 2.2.13 α-L-鼠李糖苷酶突变体库的高通量筛选 | 第26-27页 |
| 2.2.14 突变体测序结果 | 第27-28页 |
| 2.3 结果和分析 | 第28-32页 |
| 2.3.1 易错PCR(epPCR)条件的确定 | 第28页 |
| 2.3.2 利用易错PCR进行突变文库的构建 | 第28-29页 |
| 2.3.3 突变库的筛选 | 第29-30页 |
| 2.3.4 pNP标准曲线 | 第30-31页 |
| 2.3.5 突变体突变区域的确定 | 第31-32页 |
| 2.4 小结 | 第32-34页 |
| 第3章 二级结构的预测及三级结构的建模 | 第34-45页 |
| 3.1 试验材料与方法 | 第34页 |
| 3.1.1 二级结构预测服务 | 第34页 |
| 3.1.2 序列比对和同源建模模板搜索服务器 | 第34页 |
| 3.2 三级结构建模 | 第34页 |
| 3.2.1 三级结构模型构建软件 | 第34页 |
| 3.2.2 三级结构模型评估 | 第34页 |
| 3.3 软件 | 第34-35页 |
| 3.4 方法 | 第35-36页 |
| 3.4.1 二级结构的预测及分析 | 第35页 |
| 3.4.2 三级结构的建模 | 第35页 |
| 3.4.3 模型的优化 | 第35-36页 |
| 3.5 结果和分析 | 第36-43页 |
| 3.5.1 二级结构的预测 | 第36-38页 |
| 3.5.2 模板的搜索 | 第38-39页 |
| 3.5.3 三级结构的建模 | 第39-41页 |
| 3.5.4 模型的评价 | 第41-43页 |
| 3.6 小结 | 第43-45页 |
| 第4章 D80N/V529A定点突变的研究 | 第45-57页 |
| 4.1 试验材料及仪器 | 第45页 |
| 4.1.1 菌株及载体 | 第45页 |
| 4.1.2 主要仪器 | 第45页 |
| 4.2 实验方法 | 第45-48页 |
| 4.2.1 重叠PCR法构建单点突变 | 第45-46页 |
| 4.2.2 上下游片段的重叠PCR | 第46-47页 |
| 4.2.3 目的基因与载体的双酶切 | 第47页 |
| 4.2.4 目的基因与载体的连接 | 第47页 |
| 4.2.5 单点突变的大肠杆菌转化实验 | 第47页 |
| 4.2.6 单点突变的真核表达 | 第47页 |
| 4.2.7 重组酶及r-Rha1的分离纯化 | 第47页 |
| 4.2.8 SDS-PAGE电泳分析 | 第47-48页 |
| 4.2.9 突变体热稳性的研究 | 第48页 |
| 4.2.10 突变位点的微观研究 | 第48页 |
| 4.3 结果分析与讨论 | 第48-56页 |
| 4.3.1 定点突变结果 | 第48-50页 |
| 4.3.2 pPIC9k-各点突变/DH5α阳性克隆 | 第50-51页 |
| 4.3.3 pPIC9k-各突变体的真核表达 | 第51-52页 |
| 4.3.4 突变体的SDS-PAGE分析 | 第52页 |
| 4.3.5 WT及突变体热稳定性的研究 | 第52-54页 |
| 4.3.6 突变位点的研究, | 第54-56页 |
| 4.4 小结 | 第56-57页 |
| 第5章 WT及突变体酶学性质的研究及其应用 | 第57-70页 |
| 5.1 实验试剂及仪器 | 第57页 |
| 5.2 实验方法 | 第57-59页 |
| 5.2.1 WT及各突变体的最适pH | 第57页 |
| 5.2.2 WT及各突变体的pH稳定性 | 第57页 |
| 5.2.3 WT及各突变体的最适温度 | 第57页 |
| 5.2.4 WT及各突变体酶活的测定 | 第57-58页 |
| 5.2.5 金属离子对WT及各突变体水解人工底物的影响 | 第58页 |
| 5.2.6 效应物对WT及各突变体水解人工底物的影响 | 第58页 |
| 5.2.7 WT及突变体酶的应用 | 第58-59页 |
| 5.3 结果和分析 | 第59-68页 |
| 5.3.1 WT及突变体活性的研究 | 第59页 |
| 5.3.2 WT及突变体的最适温度的研究 | 第59-60页 |
| 5.3.3 WT及突变体最适pH的研究 | 第60页 |
| 5.3.4 WT及突变体pH稳定性的研究 | 第60-61页 |
| 5.3.5 金属离子对WT及突变体影响作用的研究 | 第61-62页 |
| 5.3.6 效应物对WT及突变体影响作用的研究 | 第62-64页 |
| 5.3.7 WT及突变体的应用 | 第64-68页 |
| 5.4 小结 | 第68-70页 |
| 第6章 结论与展望 | 第70-72页 |
| 6.1 结论 | 第70-71页 |
| 6.2 展望 | 第71-72页 |
| 致谢 | 第72-73页 |
| 参考文献 | 第73-80页 |
| 在学期间发表的学术论文 | 第80页 |
