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定向进化提高Pseudoalteromonas carrageenovora芳香基硫酸酯酶热稳定性的研究

摘要第4-6页
abstract第6-7页
主要符号表第12-13页
第1章 引言第13-22页
    1.1 硫酸酯酶概述第13-16页
        1.1.1 硫酸酯酶第13页
        1.1.2 芳香基硫酸酯酶第13-16页
    1.2 琼脂第16-17页
        1.2.1 琼脂的化学结构第16页
        1.2.2 琼脂硫酸基团的脱除第16-17页
        1.2.3 琼脂的应用第17页
    1.3 酶的定向进化第17-20页
        1.3.1 概述第17-18页
        1.3.2 定向进化的主要方法第18-20页
    1.4 课题简介第20-22页
        1.4.1 课题研究的目的及意义第20-21页
        1.4.2 课题研究内容第21-22页
第2章 P.carrageenovora芳香基硫酸酯酶突变文库的构建与筛选第22-34页
    2.1 实验材料及仪器第22-23页
        2.1.1 菌株第22页
        2.1.2 质粒载体第22页
        2.1.3 试剂盒第22页
        2.1.4 生化试剂第22页
        2.1.5 常用溶液及培养基配制第22-23页
        2.1.6 主要实验仪器第23页
    2.2 实验方法第23-28页
        2.2.1 芳香基硫酸酯酶重组DH5α菌株的活化第23页
        2.2.2 芳香基硫酸酯酶重组质粒的提取第23-24页
        2.2.3 易错PCR及条件优化第24-25页
        2.2.4 易错PCR产物的纯化第25页
        2.2.5 E.coil感受态细胞的制备第25-26页
        2.2.6 突变频率的测定第26页
        2.2.7 DNA与表达载体的酶切和连接第26页
        2.2.8 突变文库的构建第26页
        2.2.9 突变文库阳性克隆率的分析第26-27页
        2.2.10 突变文库的筛选第27页
        2.2.11 突变体的基因序列鉴定第27-28页
        2.2.12 芳香基硫酸酯酶的活力测定第28页
        2.2.13 突变酶的表达、纯化及热稳定性研究第28页
    2.3 结果与分析第28-32页
        2.3.1 芳香基硫酸酯酶重组质粒的提取第28-29页
        2.3.2 易错PCR条件的优化第29-30页
        2.3.3 突变文库阳性克隆率的分析第30页
        2.3.4 突变文库的筛选及突变体的鉴定第30-31页
        2.3.5 突变芳香基硫酸酯酶的纯化第31-32页
        2.3.6 突变芳香基硫酸酯酶的热稳定性研究第32页
    2.4 本章小结第32-34页
第3章 P.carrageenovora芳香基硫酸酯酶的二级结构分析及三级结构建模第34-43页
    3.1 实验材料及仪器第34页
        3.1.1 分析网站第34页
        3.1.2 软件第34页
        3.1.3 主要实验仪器第34页
    3.2 实验方法第34-35页
        3.2.1 二级结构分析第34-35页
        3.2.2 三级结构的建模与评价第35页
    3.3 结果与分析第35-41页
        3.3.1 二级结构的信息学预测第35-37页
        3.3.2 圆二色谱分析第37-39页
        3.3.3 三维结构模型的建立第39-40页
        3.3.4 三维模型的评价第40-41页
    3.4 本章小结第41-43页
第4章 P.carrageenovora芳香基硫酸酯酶热稳定性改造有效位点的研究第43-53页
    4.1 实验材料及仪器第43页
        4.1.1 实验菌株第43页
        4.1.2 常用溶液及培养基配制第43页
        4.1.3 主要实验仪器第43页
    4.2 实验方法第43-47页
        4.2.1 突变引物的设计第43-44页
        4.2.2 D83A定点突变第44-45页
        4.2.3 D83A、H259L和4-153突变体的表达与纯化第45-46页
        4.2.4 温度对D83A、H259L和4-153突变酶活性的影响第46页
        4.2.5 259位氨基酸的饱和突变第46页
        4.2.6 259位饱和突变酶热稳定性的研究第46页
        4.2.7 芳香基硫酸酯酶的微观结构分析第46-47页
    4.3 结果与分析第47-52页
        4.3.1 温度对D83A、H259L和4-153突变酶活性的影响第47-48页
        4.3.2 259位饱和突变酶的热稳定性第48-49页
        4.3.3 259位氨基酸残基及其周围的微观结构分析第49-52页
    4.4 本章小结第52-53页
第5章 热稳定性提高突变体酶的性质研究第53-62页
    5.1 实验材料及仪器第53页
        5.1.1 常用试剂及缓冲液配制第53页
        5.1.2 主要实验仪器第53页
    5.2 实验方法第53-55页
        5.2.1 芳香基硫酸酯酶的酶学性质研究第53-54页
        5.2.2 芳香基硫酸酯酶脱除江篱琼脂粗多糖硫酸基团的研究第54-55页
    5.3 结果与分析第55-61页
        5.3.1 pH对酶活力的影响第55-56页
        5.3.2 金属离子对酶活力的影响第56-57页
        5.3.3 抑制剂和去垢剂对酶活力的影响第57-59页
        5.3.4 酶的动力学参数第59-60页
        5.3.5 突变酶去除琼脂粗多糖的硫酸基第60-61页
    5.4 本章小结第61-62页
第6章 结论与展望第62-65页
    6.1 结论第62-63页
    6.2 展望第63-65页
致谢第65-66页
参考文献第66-73页
在学期间发表的学术论文第73页

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