| 摘要 | 第4-6页 |
| abstract | 第6-7页 |
| 主要符号表 | 第12-13页 |
| 第1章 引言 | 第13-22页 |
| 1.1 硫酸酯酶概述 | 第13-16页 |
| 1.1.1 硫酸酯酶 | 第13页 |
| 1.1.2 芳香基硫酸酯酶 | 第13-16页 |
| 1.2 琼脂 | 第16-17页 |
| 1.2.1 琼脂的化学结构 | 第16页 |
| 1.2.2 琼脂硫酸基团的脱除 | 第16-17页 |
| 1.2.3 琼脂的应用 | 第17页 |
| 1.3 酶的定向进化 | 第17-20页 |
| 1.3.1 概述 | 第17-18页 |
| 1.3.2 定向进化的主要方法 | 第18-20页 |
| 1.4 课题简介 | 第20-22页 |
| 1.4.1 课题研究的目的及意义 | 第20-21页 |
| 1.4.2 课题研究内容 | 第21-22页 |
| 第2章 P.carrageenovora芳香基硫酸酯酶突变文库的构建与筛选 | 第22-34页 |
| 2.1 实验材料及仪器 | 第22-23页 |
| 2.1.1 菌株 | 第22页 |
| 2.1.2 质粒载体 | 第22页 |
| 2.1.3 试剂盒 | 第22页 |
| 2.1.4 生化试剂 | 第22页 |
| 2.1.5 常用溶液及培养基配制 | 第22-23页 |
| 2.1.6 主要实验仪器 | 第23页 |
| 2.2 实验方法 | 第23-28页 |
| 2.2.1 芳香基硫酸酯酶重组DH5α菌株的活化 | 第23页 |
| 2.2.2 芳香基硫酸酯酶重组质粒的提取 | 第23-24页 |
| 2.2.3 易错PCR及条件优化 | 第24-25页 |
| 2.2.4 易错PCR产物的纯化 | 第25页 |
| 2.2.5 E.coil感受态细胞的制备 | 第25-26页 |
| 2.2.6 突变频率的测定 | 第26页 |
| 2.2.7 DNA与表达载体的酶切和连接 | 第26页 |
| 2.2.8 突变文库的构建 | 第26页 |
| 2.2.9 突变文库阳性克隆率的分析 | 第26-27页 |
| 2.2.10 突变文库的筛选 | 第27页 |
| 2.2.11 突变体的基因序列鉴定 | 第27-28页 |
| 2.2.12 芳香基硫酸酯酶的活力测定 | 第28页 |
| 2.2.13 突变酶的表达、纯化及热稳定性研究 | 第28页 |
| 2.3 结果与分析 | 第28-32页 |
| 2.3.1 芳香基硫酸酯酶重组质粒的提取 | 第28-29页 |
| 2.3.2 易错PCR条件的优化 | 第29-30页 |
| 2.3.3 突变文库阳性克隆率的分析 | 第30页 |
| 2.3.4 突变文库的筛选及突变体的鉴定 | 第30-31页 |
| 2.3.5 突变芳香基硫酸酯酶的纯化 | 第31-32页 |
| 2.3.6 突变芳香基硫酸酯酶的热稳定性研究 | 第32页 |
| 2.4 本章小结 | 第32-34页 |
| 第3章 P.carrageenovora芳香基硫酸酯酶的二级结构分析及三级结构建模 | 第34-43页 |
| 3.1 实验材料及仪器 | 第34页 |
| 3.1.1 分析网站 | 第34页 |
| 3.1.2 软件 | 第34页 |
| 3.1.3 主要实验仪器 | 第34页 |
| 3.2 实验方法 | 第34-35页 |
| 3.2.1 二级结构分析 | 第34-35页 |
| 3.2.2 三级结构的建模与评价 | 第35页 |
| 3.3 结果与分析 | 第35-41页 |
| 3.3.1 二级结构的信息学预测 | 第35-37页 |
| 3.3.2 圆二色谱分析 | 第37-39页 |
| 3.3.3 三维结构模型的建立 | 第39-40页 |
| 3.3.4 三维模型的评价 | 第40-41页 |
| 3.4 本章小结 | 第41-43页 |
| 第4章 P.carrageenovora芳香基硫酸酯酶热稳定性改造有效位点的研究 | 第43-53页 |
| 4.1 实验材料及仪器 | 第43页 |
| 4.1.1 实验菌株 | 第43页 |
| 4.1.2 常用溶液及培养基配制 | 第43页 |
| 4.1.3 主要实验仪器 | 第43页 |
| 4.2 实验方法 | 第43-47页 |
| 4.2.1 突变引物的设计 | 第43-44页 |
| 4.2.2 D83A定点突变 | 第44-45页 |
| 4.2.3 D83A、H259L和4-153突变体的表达与纯化 | 第45-46页 |
| 4.2.4 温度对D83A、H259L和4-153突变酶活性的影响 | 第46页 |
| 4.2.5 259位氨基酸的饱和突变 | 第46页 |
| 4.2.6 259位饱和突变酶热稳定性的研究 | 第46页 |
| 4.2.7 芳香基硫酸酯酶的微观结构分析 | 第46-47页 |
| 4.3 结果与分析 | 第47-52页 |
| 4.3.1 温度对D83A、H259L和4-153突变酶活性的影响 | 第47-48页 |
| 4.3.2 259位饱和突变酶的热稳定性 | 第48-49页 |
| 4.3.3 259位氨基酸残基及其周围的微观结构分析 | 第49-52页 |
| 4.4 本章小结 | 第52-53页 |
| 第5章 热稳定性提高突变体酶的性质研究 | 第53-62页 |
| 5.1 实验材料及仪器 | 第53页 |
| 5.1.1 常用试剂及缓冲液配制 | 第53页 |
| 5.1.2 主要实验仪器 | 第53页 |
| 5.2 实验方法 | 第53-55页 |
| 5.2.1 芳香基硫酸酯酶的酶学性质研究 | 第53-54页 |
| 5.2.2 芳香基硫酸酯酶脱除江篱琼脂粗多糖硫酸基团的研究 | 第54-55页 |
| 5.3 结果与分析 | 第55-61页 |
| 5.3.1 pH对酶活力的影响 | 第55-56页 |
| 5.3.2 金属离子对酶活力的影响 | 第56-57页 |
| 5.3.3 抑制剂和去垢剂对酶活力的影响 | 第57-59页 |
| 5.3.4 酶的动力学参数 | 第59-60页 |
| 5.3.5 突变酶去除琼脂粗多糖的硫酸基 | 第60-61页 |
| 5.4 本章小结 | 第61-62页 |
| 第6章 结论与展望 | 第62-65页 |
| 6.1 结论 | 第62-63页 |
| 6.2 展望 | 第63-65页 |
| 致谢 | 第65-66页 |
| 参考文献 | 第66-73页 |
| 在学期间发表的学术论文 | 第73页 |
