| 摘要 | 第8-9页 |
| abstract | 第9-10页 |
| 第一章 绪论 | 第11-21页 |
| 1.1 5-氨基乙酰丙酸简介 | 第11页 |
| 1.2 ALA的生理作用及其应用领域 | 第11-14页 |
| 1.2.1 生理作用 | 第11-13页 |
| 1.2.2 ALA的应用领域 | 第13-14页 |
| 1.3 ALA的生产方法 | 第14-15页 |
| 1.3.1 化学合成法 | 第14-15页 |
| 1.3.2 微生物转化法 | 第15页 |
| 1.4 微生物转化合成ALA的途径 | 第15-16页 |
| 1.4.1 C4途径ALA合成的调节机制 | 第15-16页 |
| 1.4.2 C5途径ALA合成的调节机制 | 第16页 |
| 1.5 生物合成ALA的研究的背景和进展 | 第16-18页 |
| 1.5.1 生物合成ALA的研究进展 | 第16-18页 |
| 1.6 毕赤酵母表达系统 | 第18页 |
| 1.7 本课题拟研究内容和方向 | 第18-21页 |
| 第二章 重组载体pGAPZA-hemA构建 | 第21-35页 |
| 2.1 实验材料 | 第21-22页 |
| 2.2 实验仪器 | 第22页 |
| 2.3 实验方法 | 第22-29页 |
| 2.3.1 载体的选择 | 第22-23页 |
| 2.3.2 酶切位点的选择 | 第23页 |
| 2.3.3 ALAS的编码基因hem A的选择 | 第23-24页 |
| 2.3.4 PCR引物的设计 | 第24页 |
| 2.3.5 酿酒酵母基因组DNA提取 | 第24页 |
| 2.3.6 目标基因片段的PCR扩增 | 第24-25页 |
| 2.3.7 PCR产物的纯化 | 第25页 |
| 2.3.8 pGAPZA载体和PCR产物分别进行双酶切 | 第25-26页 |
| 2.3.9 酶切片段胶回收 | 第26-27页 |
| 2.3.10 载体和目标基因片段连接 | 第27页 |
| 2.3.11 大肠杆菌DH5α感受态的制备 | 第27-28页 |
| 2.3.12 pGAPZA-hemA重组质粒的转化 | 第28页 |
| 2.3.13 pGAPZA-hemA重组质粒的提取 | 第28页 |
| 2.3.14 pGAPZA-hemA重组质粒的鉴定 | 第28-29页 |
| 2.4 实验结果与分析 | 第29-35页 |
| 2.4.1 酿酒酵母基因组DNA提取 | 第29页 |
| 2.4.2 目标基因片段的PCR扩增及纯化 | 第29-30页 |
| 2.4.3 pGAPZA载体和PCR产物双酶切 | 第30页 |
| 2.4.4 pGAPZA-hem A重组载体及其酶切 | 第30-31页 |
| 2.4.5 测序结果及分析 | 第31-35页 |
| 第三章 毕赤酵母GS115重组菌株的构建及筛选鉴定 | 第35-47页 |
| 3.1 实验材料 | 第35-36页 |
| 3.2 实验仪器 | 第36页 |
| 3.3 实验方法 | 第36-42页 |
| 3.3.1 pGAPZA-hemA重组载体的大量制备 | 第36-37页 |
| 3.3.2 线性化pGAPZA-hemA载体 | 第37-38页 |
| 3.3.3 线性化质粒浓度的测定及稀释 | 第38页 |
| 3.3.4 毕赤酵母电转化法感受态细胞的制备 | 第38页 |
| 3.3.5 毕赤酵母的电转化 | 第38-39页 |
| 3.3.6 筛选高拷贝的菌株 | 第39页 |
| 3.3.7 毕赤酵母重组菌株的总DNA提取 | 第39-40页 |
| 3.3.8 重组菌株的PCR验证 | 第40-41页 |
| 3.3.9 SDS-PAGE电泳分析重组菌中ALAS含量变化 | 第41页 |
| 3.3.10 分光光度法测定ALA含量—标准曲线制作 | 第41-42页 |
| 3.3.11 培养液中 ALA 含量变化的测定 | 第42页 |
| 3.4 实验结果及分析 | 第42-47页 |
| 3.4.1 提取的质粒及双酶切验证结果 | 第42-43页 |
| 3.4.2 pGAPZA-hemA载体Avr Ⅱ线性化结果 | 第43页 |
| 3.4.3 毕赤酵母电转化结果 | 第43-44页 |
| 3.4.4 毕赤酵母重组菌株基因组DNA提取结果 | 第44页 |
| 3.4.5 重组菌株PCR验证结果 | 第44-45页 |
| 3.4.6 SDS-PAGE电泳结果 | 第45页 |
| 3.4.7 ALA标准曲线 | 第45-46页 |
| 3.4.8 毕赤酵母GS115和重组菌株UJNPAALA含量变化比较结果 | 第46-47页 |
| 第四章 重组菌株UJNPA发酵转化条件优化 | 第47-65页 |
| 4.1 实验材料 | 第47页 |
| 4.2 实验仪器 | 第47-48页 |
| 4.3 实验方法 | 第48-53页 |
| 4.3.1 毕赤酵母GS115与重组菌株UJNPA生长曲线的测定 | 第48页 |
| 4.3.2 单因素实验 | 第48-51页 |
| 4.3.3 响应面实验 | 第51-52页 |
| 4.3.4 碳源优化实验 | 第52-53页 |
| 4.4 实验结果及分析 | 第53-65页 |
| 4.4.1 毕赤酵母GS115及重组菌株UJNPA生长曲线 | 第53-54页 |
| 4.4.2 琥珀酸添加量单因素实验 | 第54-55页 |
| 4.4.3 甘氨酸添加量单因素实验 | 第55页 |
| 4.4.4 丙二酸添加量单因素实验 | 第55-56页 |
| 4.4.5 大蒜提取物单因素实验 | 第56页 |
| 4.4.6 乙酰丙酸添加量单因素试验 | 第56-57页 |
| 4.4.7 甘油添加量单因素实验 | 第57页 |
| 4.4.8 响应面实验—琥珀酸、甘氨酸、丙二酸 | 第57-60页 |
| 4.4.9 响应面实验—大蒜提取物、乙酰丙酸、甘油 | 第60-63页 |
| 4.4.10 碳源优化实验结果 | 第63-65页 |
| 第五章 结论与展望 | 第65-67页 |
| 5.1 结论 | 第65页 |
| 5.2 展望 | 第65-67页 |
| 参考文献 | 第67-73页 |
| 致谢 | 第73-75页 |
| 附录 | 第75页 |
