| 摘要 | 第3-4页 |
| ABSTRACT | 第4页 |
| 第1章 前言 | 第8-20页 |
| 1.1 研究背景 | 第8-9页 |
| 1.2 苯丙氨酸研究现状 | 第9-15页 |
| 1.2.1 苯丙氨酸概述 | 第9页 |
| 1.2.2 L-Phe的功能 | 第9-10页 |
| 1.2.3 L-Phe生产方法 | 第10-15页 |
| 1.3 代谢途径关键酶研究现状 | 第15-17页 |
| 1.4 体外多酶催化的优势及应用 | 第17-18页 |
| 1.5 本文的研究内容及技术路线 | 第18-20页 |
| 第2章 材料与方法 | 第20-36页 |
| 2.1 实验材料 | 第20-25页 |
| 2.1.1 菌株、质粒及引物 | 第20-22页 |
| 2.1.2 培养基 | 第22页 |
| 2.1.3 主要试剂 | 第22-23页 |
| 2.1.4 主要溶液 | 第23-24页 |
| 2.1.5 主要仪器 | 第24-25页 |
| 2.2 实验方法 | 第25-34页 |
| 2.2.1 质粒构建 | 第25-27页 |
| 2.2.2 途径蛋白的表达、分离纯化 | 第27-29页 |
| 2.2.3 蛋白质组学分析 | 第29-30页 |
| 2.2.4 蛋白活性测定 | 第30-32页 |
| 2.2.5 动力学参数的测定 | 第32-33页 |
| 2.2.6 菌株粗酶的绝对定量 | 第33-34页 |
| 2.2.7 途径关键酶的确定 | 第34页 |
| 2.2.8 体内验证关键酶 | 第34页 |
| 2.3 L-Phe生产菌株上罐发酵 | 第34-36页 |
| 第3章 结果与分析 | 第36-54页 |
| 3.1 微生物发酵 | 第36-37页 |
| 3.1.1 出发菌株HD-1上罐发酵 | 第36页 |
| 3.1.2 小结 | 第36-37页 |
| 3.2 途径蛋白的表达、纯化及蛋白浓度的绝对定量 | 第37-39页 |
| 3.2.1 PCR扩增目的基因的电泳分析 | 第37页 |
| 3.2.2 目的基因的SDS-PAGE图谱 | 第37-38页 |
| 3.2.3 途径蛋白浓度测定 | 第38-39页 |
| 3.2.4 小结 | 第39页 |
| 3.3 蛋白活性测定 | 第39-43页 |
| 3.3.1 标准曲线 | 第39-40页 |
| 3.3.2 途径蛋白活性测定 | 第40-43页 |
| 3.3.3 小结 | 第43页 |
| 3.4 动力学参数的测定 | 第43-45页 |
| 3.4.1 比酶活 | 第43-45页 |
| 3.4.2 小结 | 第45页 |
| 3.5 途径关键酶的确定 | 第45-49页 |
| 3.5.1 确定底物莽草酸添加量 | 第45-46页 |
| 3.5.2 确定体外反应体系 | 第46-47页 |
| 3.5.3 L-Phe标准曲线 | 第47-48页 |
| 3.5.4 L-Phe生成量的测定 | 第48页 |
| 3.5.5 小结 | 第48-49页 |
| 3.6 体内关键酶验证 | 第49-52页 |
| 3.6.1 过表达莽草酸激酶(AroL)及5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(AroA)载体构建 | 第49-50页 |
| 3.6.2 过表达重组菌产L-Phe摇瓶发酵结果 | 第50-51页 |
| 3.6.3 菌株HD-L/1/2/3中AroL活性验证 | 第51页 |
| 3.6.4 小结 | 第51-52页 |
| 3.7 5微生物发酵 | 第52-54页 |
| 3.7.1 工程菌株HD-A2上罐发酵 | 第52页 |
| 3.7.2 小结 | 第52-54页 |
| 第4章 结论 | 第54-55页 |
| 第5章 展望 | 第55-56页 |
| 致谢 | 第56-57页 |
| 参考文献 | 第57-63页 |
| 攻读学位期间的研究成果 | 第63页 |