| 摘要 | 第6-8页 |
| ABSTRACT | 第8-9页 |
| 缩略词表 | 第10-12页 |
| 第一章 文献综述 | 第12-22页 |
| 引言 | 第12页 |
| 1.1 结核分枝杆菌与巨噬细胞的相互作用 | 第12-16页 |
| 1.1.1 细胞免疫与结核分枝杆菌 | 第13页 |
| 1.1.2 自噬与结核分枝杆菌 | 第13-14页 |
| 1.1.3 活性氧成分与结核分枝杆菌 | 第14-15页 |
| 1.1.4 结核分枝杆菌在宿主中的生存机制 | 第15-16页 |
| 1.2 CRISPR-Cas系统在基因敲入和基因干扰中的应用 | 第16-19页 |
| 1.2.1 CRISPR-Cas系统与基因敲入 | 第17-18页 |
| 1.2.2 CRISPR-Cas系统与真核细胞基因干扰 | 第18-19页 |
| 1.3 双荧光指示系统与细胞自噬 | 第19-22页 |
| 1.3.1 pH敏感型GFP | 第19-20页 |
| 1.3.2 串联蛋白GFPph-mCherry-LC3与自噬监视 | 第20-22页 |
| 第二章 目的与意义 | 第22-23页 |
| 第三章 材料与方法 | 第23-39页 |
| 3.1 试验材料 | 第23-27页 |
| 3.1.1 细胞、菌株、质粒及培养条件 | 第23页 |
| 3.1.2 实验仪器及耗材 | 第23-24页 |
| 3.1.3 主要的工具酶、抗体及试剂 | 第24-25页 |
| 3.1.4 主要培养基、抗生素及其配置 | 第25-26页 |
| 3.1.5 缓冲液及其配置 | 第26-27页 |
| 3.1.6 主要的生物学分析软件 | 第27页 |
| 3.2 试验方法 | 第27-39页 |
| 3.2.1 结核分枝杆菌H37Ra及耻垢分枝杆菌mc2155感受态的制备 | 第27页 |
| 3.2.2 结核分枝杆菌的电击转化 | 第27页 |
| 3.2.3 sgRNA的设计及合成 | 第27-28页 |
| 3.2.4 G418筛选浓度及维持浓度的确定 | 第28-29页 |
| 3.2.5 Raw264.7 细胞的转染及后期筛选 | 第29页 |
| 3.2.6 雷帕霉素诱导细胞自噬的分析 | 第29-30页 |
| 3.2.7 CRISPRi/CRISPRa系统的构建 | 第30-31页 |
| 3.2.8 细胞基因组的提取 | 第31页 |
| 3.2.9 Western Blot实验 | 第31-32页 |
| 3.2.10 以氯化钙法制备感受态细胞 | 第32-33页 |
| 3.2.11 相关引物的设计及合成 | 第33-34页 |
| 3.2.12 常规分子克隆实验 | 第34-39页 |
| 第四章 技术路线 | 第39-40页 |
| 第五章 结果和分析 | 第40-50页 |
| 5.1 结核分枝杆菌H37Ra表达CFP菌株的构建与鉴定 | 第40-41页 |
| 5.1.1 CFP重组表达质粒的构建 | 第40页 |
| 5.1.2 H37Ra的BFP/CFP荧光表达菌株的鉴定 | 第40-41页 |
| 5.2 双荧光巨噬细胞系的构建及验证 | 第41-46页 |
| 5.2.1 G418工作浓度的筛选 | 第41-42页 |
| 5.2.2 CRISPR相关剪切质粒的构建 | 第42页 |
| 5.2.3 EGFP基因序列的改造 | 第42-43页 |
| 5.2.4 同源重组片段的克隆 | 第43页 |
| 5.2.5 稳定转染细胞系的构建及初步筛选 | 第43-45页 |
| 5.2.6 细胞系GFPph-mCerry-LC3融合蛋白表达检测 | 第45页 |
| 5.2.7 细胞系指示自噬的功能验证 | 第45-46页 |
| 5.3 干扰自噬相关结核蛋白的筛选 | 第46-47页 |
| 5.4 鼠源自噬基因gRNA文库的构建 | 第47-50页 |
| 5.4.1 CRISPRi/CRISPRa系统功能验证 | 第47-48页 |
| 5.4.2 相关鼠源自噬基因的筛选及gRNA设计 | 第48-50页 |
| 第六章 讨论与结论 | 第50-53页 |
| 6.1 青色荧光结核分枝杆菌的构建 | 第50-51页 |
| 6.2 双荧光巨噬细胞系的构建 | 第51-52页 |
| 6.3 结核蛋白Rv0847对自噬的干扰的初步研究 | 第52页 |
| 6.4 结论 | 第52-53页 |
| 参考文献 | 第53-63页 |
| 致谢 | 第63页 |
