快速检测非洲猪瘟病毒环介导等温扩增方法的建立
| 中文摘要 | 第4-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 第一章 文献综述 | 第10-24页 |
| 1 非洲猪瘟概述 | 第10-18页 |
| 1.1 病原学及其研究进展 | 第10-13页 |
| 1.1.1 病毒的分类及结构特征 | 第10-11页 |
| 1.1.2 病毒的理化特性 | 第11页 |
| 1.1.3 病毒的主要蛋白 | 第11-12页 |
| 1.1.4 病毒的侵入机理 | 第12页 |
| 1.1.5 病毒免疫逃避机制 | 第12-13页 |
| 1.2 流行病学及其研究进展 | 第13-14页 |
| 1.2.1 易感动物和传染源 | 第13-14页 |
| 1.2.2 地理分布及传播途径 | 第14页 |
| 1.3 致病机理 | 第14-15页 |
| 1.4 临床症状及病理变化 | 第15-16页 |
| 1.5 实验室诊断方法 | 第16-17页 |
| 1.5.1 病毒分离和免疫学检测 | 第16-17页 |
| 1.5.2 分子生物学检测 | 第17页 |
| 1.6 防治措施 | 第17-18页 |
| 2. 环介导等温扩增概述 | 第18-23页 |
| 2.1 技术特点 | 第18-19页 |
| 2.2 反应原理 | 第19-21页 |
| 2.3 引物设计 | 第21页 |
| 2.4 反应体系 | 第21页 |
| 2.5 应用实例 | 第21-23页 |
| 2.5.1 LAMP技术在细菌方面的应用 | 第22页 |
| 2.5.2 LAMP技术在病毒方面的应用 | 第22页 |
| 2.5.3 LAMP技术在寄生虫方面的应用 | 第22-23页 |
| 3. 研究目的与意义 | 第23-24页 |
| 第二章 非洲猪瘟LAMP检测方法的建立 | 第24-52页 |
| 1 实验材料 | 第24-25页 |
| 1.1 主要仪器 | 第24页 |
| 1.2 实验主要试剂 | 第24-25页 |
| 1.3 相关试剂的制备 | 第25页 |
| 2 质粒模板的制备 | 第25-26页 |
| 2.1 非洲猪瘟病毒质粒的制备 | 第25页 |
| 2.2 病毒质粒浓度测定 | 第25-26页 |
| 2.3 其他病毒DNA模板的制备 | 第26页 |
| 3 非洲猪瘟病毒检测方法的建立 | 第26-33页 |
| 3.1 引物设计与合成 | 第26-27页 |
| 3.2 酶切位点分析 | 第27页 |
| 3.3 引物的验证 | 第27-28页 |
| 3.4 结果判定 | 第28页 |
| 3.5 LAMP产物的鉴定 | 第28-31页 |
| 3.5.1 LAMP产物酶切鉴定 | 第28-29页 |
| 3.5.2 LAMP产物克隆测序鉴定 | 第29-31页 |
| 3.5.2.1 LAMP产物的PCR扩增 | 第29页 |
| 3.5.2.2 PCR扩增片段的凝胶回收 | 第29-30页 |
| 3.5.2.3 感受态细胞的制备 | 第30页 |
| 3.5.2.4 重组质粒的连接 | 第30页 |
| 3.5.2.5 重组质粒的转化 | 第30-31页 |
| 3.5.2.6 测序鉴定 | 第31页 |
| 3.6 LAMP反应条件的优化 | 第31-32页 |
| 3.6.1 反应温度的优化 | 第31页 |
| 3.6.2 反应时间的优化 | 第31页 |
| 3.6.3 镁离子浓度的优化 | 第31-32页 |
| 3.6.4 dNTP浓度的优化 | 第32页 |
| 3.6.5 内外引物比例优化 | 第32页 |
| 3.6.6 甜菜碱的作用 | 第32页 |
| 3.7 PCR检测条件的优化 | 第32页 |
| 3.8 灵敏度试验 | 第32-33页 |
| 3.9 特异性试验 | 第33页 |
| 3.10 稳定性试验 | 第33页 |
| 4. 结果与分析 | 第33-46页 |
| 4.1 模板测序以及浓度的测定 | 第33页 |
| 4.2 引物验证结果 | 第33-34页 |
| 4.3 反应条件的优化 | 第34-40页 |
| 4.3.1 反应温度的优化 | 第34-35页 |
| 4.3.2 反应时间的优化 | 第35-36页 |
| 4.3.3 镁离子浓度的优化 | 第36-37页 |
| 4.3.4 dNTP浓度的优化 | 第37-38页 |
| 4.3.5 外内引物浓度比例的优化 | 第38-39页 |
| 4.3.6 甜菜碱的作用 | 第39-40页 |
| 4.4 LAMP反应条件的确立 | 第40-41页 |
| 4.5 非洲猪瘟病毒LAMP可视化检测 | 第41-42页 |
| 4.6 LAMP产物的鉴定 | 第42-43页 |
| 4.6.1 LAMP产物酶切鉴定 | 第42-43页 |
| 4.6.2 LAMP产物克隆测序鉴定 | 第43页 |
| 4.7 PCR反应条件确立 | 第43-44页 |
| 4.8 LAMP灵敏性试验 | 第44-45页 |
| 4.9 LAMP特异性试验 | 第45-46页 |
| 4.10 LAMP稳定性试验 | 第46页 |
| 5. 讨论 | 第46-51页 |
| 5.1 选题的必要性 | 第46-47页 |
| 5.2 非洲猪瘟病毒质粒模板的制备 | 第47页 |
| 5.3 建立本方法的技术优势 | 第47-48页 |
| 5.4 反应条件对LAMP的影响 | 第48-50页 |
| 5.4.1 温度对LAMP反应的影响 | 第48页 |
| 5.4.2 镁离子对LAMP反应的影响 | 第48-49页 |
| 5.4.3 引物比例对LAMP反应的影响 | 第49页 |
| 5.4.4 其他因素对LAMP反应的影响 | 第49-50页 |
| 5.5 假阳性分析及应对 | 第50-51页 |
| 6 结论 | 第51-52页 |
| 参考文献 | 第52-58页 |
| 致谢 | 第58页 |
