| 摘要 | 第1-5页 |
| ABSTRACT | 第5-13页 |
| 第1章 引言 | 第13-40页 |
| ·神经元和突触囊泡 | 第13-14页 |
| ·突触囊泡的循环 | 第14-17页 |
| ·突触囊泡与突触前膜融合的机理-SNARE 假说 | 第17页 |
| ·参与囊泡融合的几种重要蛋白 | 第17-38页 |
| ·SNARE 蛋白组分及其结构和功能 | 第18-26页 |
| ·SNARE 蛋白的结构 | 第19-22页 |
| ·SNARE 复合体的形成和解聚 | 第22-24页 |
| ·SNARE 蛋白与膜 | 第24-26页 |
| ·Synaptotagmin 蛋白的结构和功能 | 第26-28页 |
| ·Synaptotagmin 的发现和结构 | 第26-27页 |
| ·Synaptotagmin 的功能 | 第27-28页 |
| ·nSec1/Munc18（SM 蛋白）的结构和功能 | 第28-30页 |
| ·Ra63 的结构和功能 | 第30页 |
| ·α-SNAP 和NSF 蛋白的结构和功能 | 第30-33页 |
| ·Complexin 蛋白的结构和功能 | 第33-38页 |
| ·Complexin 蛋白的发现及分布 | 第33页 |
| ·Complexin 蛋白结构特点 | 第33-35页 |
| ·Complexin 蛋白的功能特征 | 第35-37页 |
| ·与complexin 相关的疾病 | 第37-38页 |
| ·本文研究内容和意义 | 第38-40页 |
| 第2章 COMPLEXIN 上参与结合SNARE 复合体的新位点 | 第40-58页 |
| ·不同来源的COMPLEXIN氨基酸序列对比 | 第40-41页 |
| ·材料与方法 | 第40页 |
| ·结果 | 第40-41页 |
| ·不同突变体对COMPLEXIN 结合SNARE 复合体的影响 | 第41-48页 |
| ·实验材料 | 第41-42页 |
| ·实验方法 | 第42-46页 |
| ·构建质粒 | 第42-44页 |
| ·蛋白的表达和纯化 | 第44-45页 |
| ·SNARE 复合体的制备 | 第45页 |
| ·Pull-down 检测 | 第45-46页 |
| ·实验结果 | 第46-48页 |
| ·蛋白样品的制备 | 第46页 |
| ·不同complexin 或其突变体结合SNARE 复合体的分析 | 第46-48页 |
| ·突变73、74、75 位的赖氨酸对COMPLEXIN结合SNARE 复合体的影响 | 第48-55页 |
| ·实验材料 | 第48页 |
| ·实验方法 | 第48-51页 |
| ·构建质粒 | 第48-49页 |
| ·蛋白的表达和纯化 | 第49页 |
| ·Pull-down 检测 | 第49页 |
| ·荧光共振能量转移 | 第49-51页 |
| ·实验结果 | 第51-55页 |
| ·突变CPXII 77 末端的三个保守的赖氨酸对CPXII 77 结合SNARE的影响 | 第51-55页 |
| ·N 端缺失对COMPLEXIN结合SNARE 复合体的影响 | 第55-56页 |
| ·实验材料 | 第55页 |
| ·实验方法 | 第55页 |
| ·实验结果 | 第55-56页 |
| ·本章小结与讨论 | 第56-58页 |
| 第3章 COMPLEXIN 与不同组装程度的SNARE 复合体之间的结合 | 第58-74页 |
| ·制备一系列模拟处于部分组装的SNARE 复合体的突变体 | 第58-64页 |
| ·实验材料 | 第58页 |
| ·实验方法 | 第58-60页 |
| ·构建质粒 | 第58-59页 |
| ·蛋白的表达和纯化 | 第59页 |
| ·SNARE 复合体的突变体的制备 | 第59页 |
| ·SNARE 复合体的突变体在不同温度下的SDS 抗性分析 | 第59-60页 |
| ·圆二色光谱分析 | 第60页 |
| ·实验结果 | 第60-64页 |
| ·由SNAP-25 突变体组成的SNARE 复合体的突变体的制备 | 第60-61页 |
| ·SNARE 突变体的稳定性表征 | 第61-64页 |
| ·分析COMPLEXIN是否能与部分组装的SNARE 复合体结合 | 第64-68页 |
| ·实验材料 | 第64页 |
| ·实验方法 | 第64-66页 |
| ·质粒的构建 | 第64页 |
| ·蛋白的表达和纯化 | 第64-65页 |
| ·PC12 细胞的培养、转染以及细胞裂解液的提取 | 第65页 |
| ·Pull-down 检测 | 第65-66页 |
| ·实验结果 | 第66-68页 |
| ·Complexin 与部分组装的SNARE 复合体结合的分析 | 第66页 |
| ·Complexin 与部分组装SNARE 复合体的结合不受SNARE 蛋白的翻译后修饰影响 | 第66-68页 |
| ·COMPLEXIN 与部分组装的SNARE 复合体在细胞膜上部分共定位 | 第68-70页 |
| ·实验材料 | 第68页 |
| ·实验方法 | 第68-69页 |
| ·真核表达融合质粒的构建 | 第68-69页 |
| ·细胞培养和转染 | 第69页 |
| ·用共聚焦荧光显微镜观察蛋白的共定位 | 第69页 |
| ·实验结果 | 第69-70页 |
| ·Complexin 与部分组装的SNARE 复合体在细胞膜上部分共定位 | 第69-70页 |
| ·COMPLEXIN 与不同组装情度的SNARE 复合体结合能力的比较 | 第70-73页 |
| ·实验材料 | 第70-71页 |
| ·实验方法 | 第71页 |
| ·荧光共振能量转移 | 第71页 |
| ·实验结果 | 第71-73页 |
| ·Complexin 结合SNARE 复合体的能力与SNARE 复合体的组装程度成正相关 | 第71-73页 |
| ·本章小结与讨论 | 第73-74页 |
| 第4章 过量表达COMPLEXIN 抑制递质释放的机理 | 第74-93页 |
| ·稳定表达COMPLEXIN的PC12 细胞系的建立 | 第75-79页 |
| ·实验材料 | 第75页 |
| ·实验方法 | 第75-77页 |
| ·真核表达质粒的构建 | 第75页 |
| ·PC12 细胞的培养和转染 | 第75-76页 |
| ·稳定表达complexin 的PC12 细胞系的筛选和鉴定 | 第76页 |
| ·检测在稳定表达细胞系中参与递质释放有关的蛋白的表达水平 | 第76页 |
| ·多克隆抗血清的制备 | 第76-77页 |
| ·实验结果 | 第77-79页 |
| ·稳定表达complexin 的PC12 细胞系的建立 | 第77-78页 |
| ·稳定表达complexin 对其他参与递质释放的蛋白表达水平的影响 | 第78-79页 |
| ·分析过量表达COMPLEXIN 对递质释放的影响 | 第79-85页 |
| ·实验材料 | 第79-80页 |
| ·实验方法 | 第80-81页 |
| ·[7,8,~3H]多巴胺释放的检测 | 第80页 |
| ·细胞中钙水平变化的检测 | 第80-81页 |
| ·实验结果 | 第81-85页 |
| ·Complexin 过量表达对递质释放的影响 | 第81-84页 |
| ·Complexin 过量表达对可释放囊泡库大小的影响 | 第84-85页 |
| ·过量表达COMPLEXIN对大致密囊泡的数目和分布的影响 | 第85-89页 |
| ·实验材料 | 第85页 |
| ·实验方法 | 第85-88页 |
| ·电镜切片的制备和观察 | 第85-88页 |
| ·实验结果 | 第88-89页 |
| ·过量表达complexin不影响PC12细胞中大致密囊泡的数目和分布 | 第88-89页 |
| ·过量表达COMPLEXIN对细胞中SNARE 复合体循环的影响 | 第89-91页 |
| ·实验材料 | 第89-90页 |
| ·实验方法 | 第90页 |
| ·细胞膜组分的制备 | 第90页 |
| ·实验结果 | 第90-91页 |
| ·过量表达complexin 导致PC12 细胞中SNARE 复合体的积累 | 第90-91页 |
| ·本章小结与讨论 | 第91-93页 |
| 第5章 利用荧光共振能量转移来研究SYNAPTOTAGMIN 胞质部分（C_2AB)的聚集 | 第93-109页 |
| ·在体外用荧光共振能量转移来分析C_2AB 的聚合 | 第93-103页 |
| ·实验材料 | 第93-94页 |
| ·实验方法 | 第94-96页 |
| ·N 端融合CFP 或YFP 的C_2AB 真核表达质粒的构建 | 第94页 |
| ·T293 细胞的培养和转染 | 第94-95页 |
| ·转染后的细胞膜组分和上清组分的制备分离 | 第95-96页 |
| ·荧光共振能量转移的检测 | 第96页 |
| ·荧光数据的处理 | 第96页 |
| ·实验结果 | 第96-103页 |
| ·融合的CFP-YFP 能产生很强的FRET 信号 | 第96-97页 |
| ·C2AB 在有钙离子和膜存在的条件下能产生FRET 信号 | 第97-101页 |
| ·膜上胆固醇和PIP_2的含量能影响C_2AB 膜上的聚合 | 第101-103页 |
| ·在细胞水平上用荧光共振能量转移来研究C_2AB 的聚合 | 第103-107页 |
| ·实验材料 | 第103页 |
| ·实验方法 | 第103-105页 |
| ·细胞的培养和转染 | 第103页 |
| ·用荧光显微镜检测C_2AB 间的FRET | 第103-105页 |
| ·实验结果 | 第105-107页 |
| ·CFP-YFP 融合蛋白在细胞中能产生很强的FRET 信号 | 第105-106页 |
| ·C_2AB 在细胞膜上能发生共振能量转移 | 第106-107页 |
| ·本章小结与讨论 | 第107-109页 |
| 第6章 结论 | 第109-112页 |
| ·论文总结 | 第109-110页 |
| ·论文工作中的问题以及展望 | 第110-112页 |
| 参考文献 | 第112-125页 |
| 致谢 | 第125-126页 |
| 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果 | 第126页 |
