| 摘要 | 第5-8页 |
| abstract | 第8-11页 |
| 第一章 绪论 | 第17-28页 |
| 1.1 哺乳动物TNF-α受体及其下游信号通路 | 第17-22页 |
| 1.1.1 TNF-α简介 | 第17-18页 |
| 1.1.2 TNF-α的Ⅰ型受体的结构和细胞定位 | 第18-19页 |
| 1.1.3 TNF-α的Ⅱ型受体的结构和细胞定位 | 第19-20页 |
| 1.1.4 TNF-α通过其受体介导的信号通路 | 第20-22页 |
| 1.2 哺乳动物TNF-α可溶性受体的存在与功能 | 第22-23页 |
| 1.2.1 TNF-α可溶性受体的发现 | 第22页 |
| 1.2.2 TNF-α可溶性受体与疾病 | 第22页 |
| 1.2.3 TNF-α可溶性受体在疾病中的应用 | 第22-23页 |
| 1.3 哺乳动物中TNF-α及其受体与细胞凋亡的关系 | 第23-24页 |
| 1.4 鱼类TNFR1和TNFR2的研究进展 | 第24-25页 |
| 1.4.1 鱼类TNFR1和TNFR2的分离克隆 | 第24页 |
| 1.4.2 鱼类TNFR1和TNFR2的表达分析和鉴定 | 第24-25页 |
| 1.5 本论文的研究意义和研究思路 | 第25-26页 |
| 1.6 本论文的主要研究内容 | 第26-28页 |
| 第二章 草鱼TNF-α受体基因的分离克隆与组织表达谱分析 | 第28-43页 |
| 2.1 概述 | 第28-29页 |
| 2.2 实验材料与方法 | 第29-33页 |
| 2.2.1 实验动物与菌株 | 第29页 |
| 2.2.2 草鱼TNFR1和TNFR2的克隆与鉴定 | 第29-31页 |
| 2.2.2.1 细胞和组织中总RNA的提取 | 第29-30页 |
| 2.2.2.2 cDNA模板的制备 | 第30页 |
| 2.2.2.3 克隆cDNA的部分序列 | 第30-31页 |
| 2.2.2.4 3 ’RACE和5’RACE获得cDNA全长序列 | 第31页 |
| 2.2.3 草鱼TNFR1和TNFR2的基因结构分析 | 第31页 |
| 2.2.4 草鱼TNFR1和TNFR2基因的生物信息学分析 | 第31-32页 |
| 2.2.5 草鱼TNFR1和TNFR2的mRNA在不同组织中的表达分析 | 第32-33页 |
| 2.2.6 统计学分析 | 第33页 |
| 2.3 实验结果 | 第33-40页 |
| 2.3.1 草鱼TNF-α受体的分子克隆与生物信息学分析 | 第33-39页 |
| 2.3.2 草鱼TNFR1和TNFR2基因的组织表达模式 | 第39-40页 |
| 2.4 讨论 | 第40-42页 |
| 2.5 本章小结 | 第42-43页 |
| 第三章 草鱼TNFR1和TNFR2基因和蛋白的诱导表达特征 | 第43-56页 |
| 3.1 概述 | 第43-44页 |
| 3.2 实验材料与方法 | 第44-48页 |
| 3.2.1 实验动物与菌株 | 第44页 |
| 3.2.2 草鱼头肾白细胞(HKLs)的分离 | 第44页 |
| 3.2.3 体外刺激下草鱼TNFR1和TNFR2的mRNA表达水平分析 | 第44页 |
| 3.2.4 体内感染后草鱼TNFR1和TNFR2的基因表达水平分析 | 第44-45页 |
| 3.2.5 草鱼TNFR1和TNFR2多克隆抗体的制备 | 第45页 |
| 3.2.6 草鱼TNFR1和TNFR2多克隆抗体的特异性验证 | 第45-47页 |
| 3.2.6.1 蛋白样品的制备 | 第45-46页 |
| 3.2.6.2 免疫印迹(WesternBlotting,WB) | 第46-47页 |
| 3.2.7 草鱼TNFR1和TNFR2的免疫组化 | 第47-48页 |
| 3.2.8 统计学分析 | 第48页 |
| 3.3 实验结果 | 第48-53页 |
| 3.3.1 脂多糖诱导草鱼TNFR1和TNFR2的基因表达 | 第48页 |
| 3.3.2 细胞因子刺激下草鱼TNFR1和TNFR2基因的表达 | 第48-49页 |
| 3.3.3 体内感染后草鱼TNFR1和TNFR2基因的诱导表达 | 第49-51页 |
| 3.3.4 草鱼TNFR1和TNFR2多克隆抗体具有特异性 | 第51-52页 |
| 3.3.5 嗜水气单胞菌感染后草鱼TNFR1和TNFR2在组织中的分布 | 第52-53页 |
| 3.4 讨论 | 第53-55页 |
| 3.5 本章小结 | 第55-56页 |
| 第四章 草鱼TNFR1和TNFR2的功能鉴定 | 第56-70页 |
| 4.1 概述 | 第56-57页 |
| 4.2 实验材料与方法 | 第57-62页 |
| 4.2.1 实验材料 | 第57页 |
| 4.2.2 启动子序列的分离 | 第57-58页 |
| 4.2.2.1 草鱼基因组的提取 | 第57页 |
| 4.2.2.2 草鱼IL-1b启动子序列的克隆与分析 | 第57-58页 |
| 4.2.2.3 草鱼IL-1b启动子荧光素酶报告质粒的构建 | 第58页 |
| 4.2.3 草鱼TNFR1和TNFR2在细胞中的过表达 | 第58-60页 |
| 4.2.3.1 草鱼TNFR1和TNFR2真核表达质粒的构建 | 第58-59页 |
| 4.2.3.2 CIK中瞬时转染草鱼TNFR1和TNFR2 | 第59-60页 |
| 4.2.3.3 COS7中过表达草鱼TNFR1和TNFR2 | 第60页 |
| 4.2.4 草鱼TNFR1和TNFR2对NF-kB活性和IL-1b启动子活性的影响 | 第60页 |
| 4.2.5 草鱼TNF-α诱导细胞凋亡的检测 | 第60-61页 |
| 4.2.5.1 根据细胞核的形态学方法检测细胞凋亡的产生 | 第60页 |
| 4.2.5.2 MTT法检测细活力 | 第60-61页 |
| 4.2.6 草鱼TNFR1和TNFR2介导TNF-α诱导的细胞凋亡检测 | 第61页 |
| 4.2.7 草鱼TNFR1和TNFR2抗体的免疫中和作用 | 第61-62页 |
| 4.2.8 统计学分析 | 第62页 |
| 4.3 实验结果 | 第62-67页 |
| 4.3.1 草鱼IL-1b启动子的克隆与序列分析 | 第62页 |
| 4.3.2 草鱼TNFR1和TNFR2在CIK中的过表达 | 第62页 |
| 4.3.3 草鱼TNFR1和TNFR2在COS7细胞中的过表达 | 第62-63页 |
| 4.3.4 草鱼TNFR1和TNFR2介导NF-kB信号通路鉴定 | 第63-64页 |
| 4.3.5 草鱼TNFR1和TNFR2介导TNF-α诱导的IL-1b转录 | 第64-65页 |
| 4.3.6 草鱼TNFR1和TNFR2介导TNF-α诱导的细胞凋亡分析 | 第65-66页 |
| 4.3.7 草鱼TNFR1和TNFR2的免疫中和作用 | 第66-67页 |
| 4.4 讨论 | 第67-69页 |
| 4.5 本章小结 | 第69-70页 |
| 第五章 草鱼可溶性TNFR1和TNFR2的鉴定及受体胞外区的重组表达与功能分析 | 第70-83页 |
| 5.1 概述 | 第70-71页 |
| 5.2 实验材料与方法 | 第71-74页 |
| 5.2.1 实验动物与菌株 | 第71页 |
| 5.2.2 草鱼可溶性TNFR1和TNFR2的检测 | 第71页 |
| 5.2.3 草鱼TNFR1和TNFR2胞外区的原核重组表达 | 第71-72页 |
| 5.2.3.1 草鱼TNFR1和TNFR2胞外区原核表达质粒的构建 | 第71页 |
| 5.2.3.2 草鱼TNFR1和TNFR2胞外区重组蛋白的诱导表达条件优化 | 第71-72页 |
| 5.2.3.3 TNFR1和TNFR2胞外区蛋白的大量诱导表达 | 第72页 |
| 5.2.4 草鱼TNFR1和TNFR2胞外区重组蛋白的纯化 | 第72-73页 |
| 5.2.5 草鱼TNFR1和TNFR2胞外区重组蛋白的纯度和特异性鉴定 | 第73页 |
| 5.2.6 草鱼TNFR1和TNFR2胞外区重组蛋白与配体的体外结合实验 | 第73页 |
| 5.2.7 草鱼TNFR1和TNFR2胞外区重组蛋白的功能鉴定 | 第73-74页 |
| 5.2.8 统计学分析 | 第74页 |
| 5.3 实验结果 | 第74-80页 |
| 5.3.1 可溶性草鱼TNFR1和TNFR2的发现 | 第74页 |
| 5.3.2 草鱼TNFR1与TNFR2胞外区蛋白的重组表达 | 第74-76页 |
| 5.3.3 草鱼TNFR1与TNFR2胞外区重组蛋白的纯化与纯度鉴定 | 第76-77页 |
| 5.3.4 草鱼TNFR1和TNFR2胞外区重组蛋白与其配体的结合 | 第77-78页 |
| 5.3.5 草鱼TNFR1和TNFR2胞外区重组蛋白在转录水平的拮抗作用 | 第78-79页 |
| 5.3.6 重组草鱼TNFR1和TNFR2抑制TNF-α诱导的细胞因子分泌 | 第79-80页 |
| 5.4 讨论 | 第80-82页 |
| 5.5 本章小结 | 第82-83页 |
| 第六章 草鱼TNFR1和TNFR2胞外区重组蛋白在细菌感染过程中的作用 | 第83-94页 |
| 6.1 概述 | 第83-84页 |
| 6.2 实验材料与方法 | 第84-85页 |
| 6.2.1 实验动物与菌种 | 第84页 |
| 6.2.2 嗜水气单胞菌的致病性验证 | 第84页 |
| 6.2.3 rgcTNFR1和rgcTNFR2处理感染嗜水气单胞菌的草鱼 | 第84-85页 |
| 6.2.4 草鱼感染后组织中细胞因子的mRNA表达水平检测 | 第85页 |
| 6.2.5 草鱼血清中生化指标的检测 | 第85页 |
| 6.2.6 草鱼组织的HE染色 | 第85页 |
| 6.2.7 统计学分析 | 第85页 |
| 6.3 实验结果 | 第85-91页 |
| 6.3.1 嗜水气单胞菌的致病性验证 | 第85-86页 |
| 6.3.2 TNFR1胞外区蛋白对菌感染后草鱼组织中细胞因子表达的影响 | 第86-87页 |
| 6.3.3 TNFR1胞外区蛋白对菌感染后草鱼血清中生化指标的影响 | 第87-88页 |
| 6.3.4 TNFR2胞外区蛋白对感染后草鱼组织病理变化的改善作用 | 第88-91页 |
| 6.4 讨论 | 第91-93页 |
| 6.5 本章小结 | 第93-94页 |
| 第七章 全文总结与展望 | 第94-96页 |
| 7.1 全文总结 | 第94-95页 |
| 7.2 后续工作展望 | 第95-96页 |
| 致谢 | 第96-98页 |
| 参考文献 | 第98-116页 |
| 攻读博士学位期间取得的成果 | 第116-117页 |
