| 学位论文数据集 | 第3-4页 |
| 摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-7页 |
| 第一章 绪论 | 第14-24页 |
| 1.1 卡那霉素 | 第14-15页 |
| 1.1.1 卡那霉素B的结构及作用 | 第14-15页 |
| 1.1.2 卡那霉素B的生物发酵 | 第15页 |
| 1.2 卡那霉素链霉菌代谢途径的研究 | 第15-18页 |
| 1.2.1 卡那霉素链霉菌双平行代谢途径 | 第15-17页 |
| 1.2.2 卡那霉素链霉菌线性代谢途径 | 第17-18页 |
| 1.3 提高链霉菌目标代谢产物方法的研究 | 第18-21页 |
| 1.3.1 加倍或者扩增抗生素代谢途径的基因 | 第18-19页 |
| 1.3.2 阻断目标产物的竞争途径 | 第19页 |
| 1.3.3 多表达正调控基因 | 第19-20页 |
| 1.3.4 阻断负调控基因 | 第20页 |
| 1.3.5 转录装置的修饰 | 第20-21页 |
| 1.4 CRISPR/Cas9在链霉菌基因工程改造中应用 | 第21-22页 |
| 1.5 论文工作意义及创新点 | 第22-24页 |
| 第二章 实验部分 | 第24-36页 |
| 2.1 实验材料 | 第24-25页 |
| 2.1.1 菌株和质粒 | 第24页 |
| 2.1.2 培养基 | 第24-25页 |
| 2.1.3 实验仪器与试剂 | 第25页 |
| 2.1.4 设计合成的引物 | 第25页 |
| 2.2 实验方法 | 第25-36页 |
| 2.2.1 抗生素的保存及使用 | 第25-26页 |
| 2.2.2 目的片段扩增与质粒构建 | 第26-29页 |
| 2.2.3 sgRNA的设计 | 第29-30页 |
| 2.2.4 Gibson组装 | 第30-31页 |
| 2.2.5 实时荧光定量PCR | 第31-33页 |
| 2.2.5.1 卡那霉素链霉菌总RNA的提取 | 第31-32页 |
| 2.2.5.2 RNA样本中DNA污染的去除 | 第32页 |
| 2.2.5.3 RT-qPCR | 第32-33页 |
| 2.2.6 接合转移 | 第33页 |
| 2.2.7 发酵和发酵产物检测 | 第33-36页 |
| 2.2.7.1 发酵与发酵液处理 | 第33页 |
| 2.2.7.2 装柱及过柱纯化 | 第33-34页 |
| 2.2.7.3 发酵产物的HPLC-ELSD检测 | 第34-36页 |
| 第三章 卡那霉素B高产菌株的构建 | 第36-48页 |
| 3.1 前言 | 第36页 |
| 3.2 孢子和菌丝体接合转移系统的对比 | 第36-38页 |
| 3.2.1 热击温度对孢子接合转移频率的影响 | 第36-37页 |
| 3.2.2 供受体比例对接合转移频率的影响 | 第37页 |
| 3.2.3 抗生素覆盖时间对接合转移频率的影响 | 第37-38页 |
| 3.2.4 小结 | 第38页 |
| 3.3 kanJ敲除菌株的构建 | 第38-44页 |
| 3.3.1 sgRNA的扩增与连接 | 第39-40页 |
| 3.3.2 kanJ左右臂的扩增与连接 | 第40-42页 |
| 3.3.3 kanJ敲除载体的电转与接合转移 | 第42-43页 |
| 3.3.4 kanJ敲除菌株的验证 | 第43-44页 |
| 3.4 原始菌株及kanJ敲除菌株的发酵 | 第44-47页 |
| 3.4.1 卡那霉素A和B标准曲线 | 第44-45页 |
| 3.4.2 卡那链霉菌的发酵及液相检测 | 第45页 |
| 3.4.3 kanJ敲除菌株的发酵及液相检测 | 第45-47页 |
| 3.5 小结 | 第47-48页 |
| 第四章 卡那霉素链霉菌调控基因功能的研究 | 第48-58页 |
| 4.1 前言 | 第48页 |
| 4.2 kanG、kanL多表达菌株的构建 | 第48-53页 |
| 4.2.1 链霉菌多表达质粒的构建 | 第48-50页 |
| 4.2.2 kanG、kanL多表达质粒的构建 | 第50-53页 |
| 4.2.2.1 kanG、kanL片段的扩增 | 第50-51页 |
| 4.2.2.2 kanG、kanL片段与pSET152~*的连接 | 第51-52页 |
| 4.2.2.3 pSET152~*-L、pSET152~*-G的电转化及接合转移 | 第52-53页 |
| 4.3 kanG、kanL表达情况分析 | 第53-56页 |
| 4.4 kanG、kanL多表达菌株的发酵 | 第56-57页 |
| 4.5 小结 | 第57-58页 |
| 第五章 结论与展望 | 第58-60页 |
| 5.1 结论 | 第58-59页 |
| 5.2 展望 | 第59-60页 |
| 参考文献 | 第60-64页 |
| 附录 | 第64-72页 |
| 致谢 | 第72-74页 |
| 研究成果及发表的学术论文 | 第74-76页 |
| 作者及导师简介 | 第76-78页 |
| 附录 | 第78-79页 |
