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新长链非编码RNA-lnc-HC在胆固醇代谢中的分子作用机制研究

摘要第3-5页
abstract第5-7页
主要符号表第18-19页
1 绪论第19-30页
    1.1 代谢综合征第19-22页
        1.1.1 代谢综合征的命名及临床表现第19-20页
        1.1.2 代谢综合征的发病机制研究第20-21页
        1.1.3 代谢综合征的诊断和治疗现状第21-22页
        1.1.4 代谢综合征差异表达基因的筛选研究第22页
    1.2 胆固醇代谢第22-25页
        1.2.1 胆固醇代谢途径第22-23页
        1.2.2 胆固醇代谢与初级脂质代谢紊乱第23-24页
        1.2.3 胆固醇代谢与代谢综合征第24页
        1.2.4 胆固醇代谢紊乱治疗现状第24-25页
    1.3 长链非编码RNA第25-29页
        1.3.1 lncRNAs的定义及发现第25-26页
        1.3.2 lncRNAs的鉴定第26-27页
        1.3.3 lncRNAs参与基因表达调控的分子机制研究第27-28页
        1.3.4 lncRNAs与代谢第28页
        1.3.5 lncRNAs与胆固醇代谢第28-29页
    1.4 小结第29-30页
2 HFD-MetS肝脏差异表达基因cDNA文库的建立第30-48页
    2.1 引言第30页
    2.2 实验材料与仪器第30-33页
        2.2.1 模型动物肝组织第30页
        2.2.2 主要试剂第30-31页
        2.2.3 引物序列第31-32页
        2.2.4 主要仪器第32-33页
    2.3 实验方法第33-41页
        2.3.1 肝脏总RNA的提取及mRNA的纯化第33-34页
        2.3.2 抑制性消减杂交第34-38页
        2.3.3 差异表达基因cDNA文库的构建第38-39页
        2.3.4 阳性克隆的筛选及鉴定第39-40页
        2.3.5 部分cDNA测序、比对及RT-qPCR验证表达差异第40-41页
        2.3.6 统计学分析第41页
    2.4 实验结果第41-46页
        2.4.1 HFD-MetS模型的评估第41-42页
        2.4.2 模型大鼠肝脏mRNA质量鉴定第42-43页
        2.4.3 抑制性消减杂交第43-44页
        2.4.4 差异表达基因cDNA文库的建立第44页
        2.4.5 部分cDNA测序及分析第44-46页
    2.5 讨论第46-48页
3 鉴定EH05为长链非编码RNA第48-64页
    3.1 引言第48页
    3.2 实验材料与仪器第48-50页
        3.2.1 主要试剂第48-49页
        3.2.2 主要试剂配制第49页
        3.2.3 引物序列第49-50页
        3.2.4 主要仪器第50页
    3.3 实验方法第50-57页
        3.3.1 EH05全长序列的获得第50-52页
        3.3.2 生物信息学分析第52-53页
        3.3.3 标签融合蛋白表达实验分析编码潜能第53-57页
    3.4 实验结果第57-62页
        3.4.1 全长序列的获得第57-59页
        3.4.2 生物信息学分析第59-60页
        3.4.3 实验验证EH05为非编码RNA第60-62页
    3.5 讨论第62-64页
4 lnc-HC在肝组织的表达鉴定第64-73页
    4.1 引言第64页
    4.2 实验材料与仪器第64-65页
        4.2.1 主要试剂第64-65页
        4.2.2 引物序列第65页
        4.2.3 主要仪器第65页
    4.3 实验方法第65-69页
        4.3.1 lnc-HC作为独立转录本的鉴定第65-68页
        4.3.2 lnc-HC在大鼠肝脏、胰腺、肌肉及脂肪的表达分析第68页
        4.3.3 lnc-HC在肝细胞的表达定位第68-69页
        4.3.4 统计学分析第69页
    4.4 实验结果第69-71页
        4.4.1 lnc-HC是独立转录本第69-70页
        4.4.2 lnc-HC高表达于肝组织第70页
        4.4.3 lnc-HC定位于肝细胞的细胞核第70-71页
    4.5 讨论第71-73页
5 lnc-HC在胆固醇代谢中的作用第73-90页
    5.1 引言第73页
    5.2 实验材料与仪器第73-76页
        5.2.1 细胞系、载体及实验动物第73-74页
        5.2.2 主要试剂第74-76页
        5.2.3 相关引物序列第76页
        5.2.4 主要仪器第76页
    5.3 实验方法第76-81页
        5.3.1 大鼠肝癌细胞系CBRH-7919的培养第76页
        5.3.2 lnc-HC高表达/敲低重组体构建第76-78页
        5.3.3 lnc-HC高表达/敲低重组体稳定转染CBRH-7919细胞克隆的筛选第78-79页
        5.3.4 lnc-HC高表达对胆固醇代谢关键分子的影响第79页
        5.3.5 lnc-HC敲低对胆固醇代谢关键分子的影响第79-80页
        5.3.6 高胆固醇对lnc-HC高表达/敲低稳定细胞系的影响第80页
        5.3.7 在体干扰lnc-HC对动物模型的影响第80页
        5.3.8 统计学分析第80-81页
    5.4 结果第81-88页
        5.4.1 lnc-HC高表达/敲低重组体构建第81页
        5.4.2 lnc-HC高表达稳定细胞系中胆固醇代谢关键分子的表达第81-82页
        5.4.3 lnc-HC敲低稳定细胞系中胆固醇代谢关键分子的表达第82-84页
        5.4.4 lnc-HC在高胆固醇情况下抑制关键分子表达第84-85页
        5.4.5 lnc-HC在体干扰效率的鉴定第85页
        5.4.6 lnc-HC在体干扰后胆固醇代谢关键分子的表达检测第85-86页
        5.4.7 lnc-HC在体干扰后代谢相关指标的检测第86-88页
    5.5 讨论第88-90页
6 lnc-HC调控Cyp7a1和Abca1表达的分子机制研究第90-103页
    6.1 引言第90页
    6.2 实验材料与仪器第90-91页
        6.2.1 主要试剂第90-91页
        6.2.2 引物序列第91页
        6.2.3 主要仪器(见2.2.4)第91页
    6.3 实验方法第91-97页
        6.3.1 lnc-HC共调节蛋白的鉴定第91-93页
        6.3.2 lnc-HC与hnRNPA2B1的结合验证第93-94页
        6.3.3 lnc-HC、hnRNPA2B1和靶基因mRNA的相互作用研究第94-96页
        6.3.4 hnRNPA2B1对Cyp7a1和Abca1基因表达的影响第96-97页
        6.3.5 统计学分析第97页
    6.4 实验结果第97-101页
        6.4.1 Biotin-labelinglnc-HC的体外转录第97页
        6.4.2 Biotin-labelinglnc-HC的RNApull-down结果第97-98页
        6.4.3 Biotin-labelinglnc-HC截短体的体外转录第98页
        6.4.4 lnc-HC与hnRNPA2B1的结合位点研究第98-99页
        6.4.5 RIP在体验证hnRNPA2B1与lnc-HC的结合第99页
        6.4.6 lnc-HC对hnRNPA2B1的表达及转位影响第99-100页
        6.4.7 lnc-HC、hnRNPA2B1和靶基因mRNA的相互结合关系第100-101页
        6.4.8 hnRNPA2B1对Cyp7a1和Abca1基因表达的影响第101页
    6.5 结论第101-103页
7 lnc-HC核心启动子区的确定第103-112页
    7.1 引言第103页
    7.2 实验材料与仪器第103-104页
        7.2.1 主要试剂第103页
        7.2.2 引物序列第103-104页
        7.2.3 主要仪器第104页
    7.3 实验方法第104-108页
        7.3.1 胆固醇对lnc-HC的表达调控第104-105页
        7.3.2 CRISPR/Cas9敲除Slc25a15基因启动子区第105页
        7.3.3 lnc-HC启动子报告基因载体的构建及鉴定第105-106页
        7.3.4 胆固醇对lnc-HC启动子转录活性的影响第106-107页
        7.3.5 统计学分析第107-108页
    7.4 实验结果第108-111页
        7.4.1 高浓度胆固醇上调lnc-HC的表达水平第108-109页
        7.4.2 Slc25a15启动子敲除鉴定第109页
        7.4.3 lnc-HC启动子截短体报告基因载体的构建第109-110页
        7.4.4 胆固醇可以增强lnc-HC近端核心启动子区的活性第110-111页
    7.5 讨论第111-112页
8 胆固醇上调lnc-HC表达水平的分子机制研究第112-123页
    8.1 引言第112页
    8.2 实验材料与仪器第112-113页
        8.2.1 主要试剂第112页
        8.2.2 引物序列第112-113页
        8.2.3 主要仪器第113页
    8.3 实验方法第113-117页
        8.3.1 lnc-HC核心启动子区结合TFs的预测第113-114页
        8.3.2 ChIP验证预测TFs在lnc-HC启动子区的结合位点第114-115页
        8.3.3 TFs结合位点点突变实验第115-116页
        8.3.4 C/EBPβ高表达/敲低对lnc-HC核心启动子转录活性的影响第116-117页
        8.3.5 LXRα激动剂对C/EBPβ和lnc-HC表达水平的影响第117页
        8.3.6 统计学分析第117页
    8.4 实验结果第117-121页
        8.4.1 lnc-HC核心启动子区结合TFs的预测结果第117-118页
        8.4.2 ChIP证实C/EBPβ参与胆固醇上调lnc-HC的调控过程第118页
        8.4.3 胆固醇对lnc-HC启动子突变体的活性影响第118-119页
        8.4.4 C/EBPβ调节lnc-HC核心启动子的转录活性第119-120页
        8.4.5 LXRα激动剂上调C/EBPβ和lnc-HC的表达水平第120-121页
    8.5 讨论第121-123页
9 结论与展望第123-125页
    9.1 结论第123-124页
    9.2 展望第124-125页
致谢第125-126页
参考文献第126-135页
攻读学位期间取得的研究成果第135-138页

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