摘要 | 第3-5页 |
abstract | 第5-7页 |
主要符号表 | 第18-19页 |
1 绪论 | 第19-30页 |
1.1 代谢综合征 | 第19-22页 |
1.1.1 代谢综合征的命名及临床表现 | 第19-20页 |
1.1.2 代谢综合征的发病机制研究 | 第20-21页 |
1.1.3 代谢综合征的诊断和治疗现状 | 第21-22页 |
1.1.4 代谢综合征差异表达基因的筛选研究 | 第22页 |
1.2 胆固醇代谢 | 第22-25页 |
1.2.1 胆固醇代谢途径 | 第22-23页 |
1.2.2 胆固醇代谢与初级脂质代谢紊乱 | 第23-24页 |
1.2.3 胆固醇代谢与代谢综合征 | 第24页 |
1.2.4 胆固醇代谢紊乱治疗现状 | 第24-25页 |
1.3 长链非编码RNA | 第25-29页 |
1.3.1 lncRNAs的定义及发现 | 第25-26页 |
1.3.2 lncRNAs的鉴定 | 第26-27页 |
1.3.3 lncRNAs参与基因表达调控的分子机制研究 | 第27-28页 |
1.3.4 lncRNAs与代谢 | 第28页 |
1.3.5 lncRNAs与胆固醇代谢 | 第28-29页 |
1.4 小结 | 第29-30页 |
2 HFD-MetS肝脏差异表达基因cDNA文库的建立 | 第30-48页 |
2.1 引言 | 第30页 |
2.2 实验材料与仪器 | 第30-33页 |
2.2.1 模型动物肝组织 | 第30页 |
2.2.2 主要试剂 | 第30-31页 |
2.2.3 引物序列 | 第31-32页 |
2.2.4 主要仪器 | 第32-33页 |
2.3 实验方法 | 第33-41页 |
2.3.1 肝脏总RNA的提取及mRNA的纯化 | 第33-34页 |
2.3.2 抑制性消减杂交 | 第34-38页 |
2.3.3 差异表达基因cDNA文库的构建 | 第38-39页 |
2.3.4 阳性克隆的筛选及鉴定 | 第39-40页 |
2.3.5 部分cDNA测序、比对及RT-qPCR验证表达差异 | 第40-41页 |
2.3.6 统计学分析 | 第41页 |
2.4 实验结果 | 第41-46页 |
2.4.1 HFD-MetS模型的评估 | 第41-42页 |
2.4.2 模型大鼠肝脏mRNA质量鉴定 | 第42-43页 |
2.4.3 抑制性消减杂交 | 第43-44页 |
2.4.4 差异表达基因cDNA文库的建立 | 第44页 |
2.4.5 部分cDNA测序及分析 | 第44-46页 |
2.5 讨论 | 第46-48页 |
3 鉴定EH05为长链非编码RNA | 第48-64页 |
3.1 引言 | 第48页 |
3.2 实验材料与仪器 | 第48-50页 |
3.2.1 主要试剂 | 第48-49页 |
3.2.2 主要试剂配制 | 第49页 |
3.2.3 引物序列 | 第49-50页 |
3.2.4 主要仪器 | 第50页 |
3.3 实验方法 | 第50-57页 |
3.3.1 EH05全长序列的获得 | 第50-52页 |
3.3.2 生物信息学分析 | 第52-53页 |
3.3.3 标签融合蛋白表达实验分析编码潜能 | 第53-57页 |
3.4 实验结果 | 第57-62页 |
3.4.1 全长序列的获得 | 第57-59页 |
3.4.2 生物信息学分析 | 第59-60页 |
3.4.3 实验验证EH05为非编码RNA | 第60-62页 |
3.5 讨论 | 第62-64页 |
4 lnc-HC在肝组织的表达鉴定 | 第64-73页 |
4.1 引言 | 第64页 |
4.2 实验材料与仪器 | 第64-65页 |
4.2.1 主要试剂 | 第64-65页 |
4.2.2 引物序列 | 第65页 |
4.2.3 主要仪器 | 第65页 |
4.3 实验方法 | 第65-69页 |
4.3.1 lnc-HC作为独立转录本的鉴定 | 第65-68页 |
4.3.2 lnc-HC在大鼠肝脏、胰腺、肌肉及脂肪的表达分析 | 第68页 |
4.3.3 lnc-HC在肝细胞的表达定位 | 第68-69页 |
4.3.4 统计学分析 | 第69页 |
4.4 实验结果 | 第69-71页 |
4.4.1 lnc-HC是独立转录本 | 第69-70页 |
4.4.2 lnc-HC高表达于肝组织 | 第70页 |
4.4.3 lnc-HC定位于肝细胞的细胞核 | 第70-71页 |
4.5 讨论 | 第71-73页 |
5 lnc-HC在胆固醇代谢中的作用 | 第73-90页 |
5.1 引言 | 第73页 |
5.2 实验材料与仪器 | 第73-76页 |
5.2.1 细胞系、载体及实验动物 | 第73-74页 |
5.2.2 主要试剂 | 第74-76页 |
5.2.3 相关引物序列 | 第76页 |
5.2.4 主要仪器 | 第76页 |
5.3 实验方法 | 第76-81页 |
5.3.1 大鼠肝癌细胞系CBRH-7919的培养 | 第76页 |
5.3.2 lnc-HC高表达/敲低重组体构建 | 第76-78页 |
5.3.3 lnc-HC高表达/敲低重组体稳定转染CBRH-7919细胞克隆的筛选 | 第78-79页 |
5.3.4 lnc-HC高表达对胆固醇代谢关键分子的影响 | 第79页 |
5.3.5 lnc-HC敲低对胆固醇代谢关键分子的影响 | 第79-80页 |
5.3.6 高胆固醇对lnc-HC高表达/敲低稳定细胞系的影响 | 第80页 |
5.3.7 在体干扰lnc-HC对动物模型的影响 | 第80页 |
5.3.8 统计学分析 | 第80-81页 |
5.4 结果 | 第81-88页 |
5.4.1 lnc-HC高表达/敲低重组体构建 | 第81页 |
5.4.2 lnc-HC高表达稳定细胞系中胆固醇代谢关键分子的表达 | 第81-82页 |
5.4.3 lnc-HC敲低稳定细胞系中胆固醇代谢关键分子的表达 | 第82-84页 |
5.4.4 lnc-HC在高胆固醇情况下抑制关键分子表达 | 第84-85页 |
5.4.5 lnc-HC在体干扰效率的鉴定 | 第85页 |
5.4.6 lnc-HC在体干扰后胆固醇代谢关键分子的表达检测 | 第85-86页 |
5.4.7 lnc-HC在体干扰后代谢相关指标的检测 | 第86-88页 |
5.5 讨论 | 第88-90页 |
6 lnc-HC调控Cyp7a1和Abca1表达的分子机制研究 | 第90-103页 |
6.1 引言 | 第90页 |
6.2 实验材料与仪器 | 第90-91页 |
6.2.1 主要试剂 | 第90-91页 |
6.2.2 引物序列 | 第91页 |
6.2.3 主要仪器(见2.2.4) | 第91页 |
6.3 实验方法 | 第91-97页 |
6.3.1 lnc-HC共调节蛋白的鉴定 | 第91-93页 |
6.3.2 lnc-HC与hnRNPA2B1的结合验证 | 第93-94页 |
6.3.3 lnc-HC、hnRNPA2B1和靶基因mRNA的相互作用研究 | 第94-96页 |
6.3.4 hnRNPA2B1对Cyp7a1和Abca1基因表达的影响 | 第96-97页 |
6.3.5 统计学分析 | 第97页 |
6.4 实验结果 | 第97-101页 |
6.4.1 Biotin-labelinglnc-HC的体外转录 | 第97页 |
6.4.2 Biotin-labelinglnc-HC的RNApull-down结果 | 第97-98页 |
6.4.3 Biotin-labelinglnc-HC截短体的体外转录 | 第98页 |
6.4.4 lnc-HC与hnRNPA2B1的结合位点研究 | 第98-99页 |
6.4.5 RIP在体验证hnRNPA2B1与lnc-HC的结合 | 第99页 |
6.4.6 lnc-HC对hnRNPA2B1的表达及转位影响 | 第99-100页 |
6.4.7 lnc-HC、hnRNPA2B1和靶基因mRNA的相互结合关系 | 第100-101页 |
6.4.8 hnRNPA2B1对Cyp7a1和Abca1基因表达的影响 | 第101页 |
6.5 结论 | 第101-103页 |
7 lnc-HC核心启动子区的确定 | 第103-112页 |
7.1 引言 | 第103页 |
7.2 实验材料与仪器 | 第103-104页 |
7.2.1 主要试剂 | 第103页 |
7.2.2 引物序列 | 第103-104页 |
7.2.3 主要仪器 | 第104页 |
7.3 实验方法 | 第104-108页 |
7.3.1 胆固醇对lnc-HC的表达调控 | 第104-105页 |
7.3.2 CRISPR/Cas9敲除Slc25a15基因启动子区 | 第105页 |
7.3.3 lnc-HC启动子报告基因载体的构建及鉴定 | 第105-106页 |
7.3.4 胆固醇对lnc-HC启动子转录活性的影响 | 第106-107页 |
7.3.5 统计学分析 | 第107-108页 |
7.4 实验结果 | 第108-111页 |
7.4.1 高浓度胆固醇上调lnc-HC的表达水平 | 第108-109页 |
7.4.2 Slc25a15启动子敲除鉴定 | 第109页 |
7.4.3 lnc-HC启动子截短体报告基因载体的构建 | 第109-110页 |
7.4.4 胆固醇可以增强lnc-HC近端核心启动子区的活性 | 第110-111页 |
7.5 讨论 | 第111-112页 |
8 胆固醇上调lnc-HC表达水平的分子机制研究 | 第112-123页 |
8.1 引言 | 第112页 |
8.2 实验材料与仪器 | 第112-113页 |
8.2.1 主要试剂 | 第112页 |
8.2.2 引物序列 | 第112-113页 |
8.2.3 主要仪器 | 第113页 |
8.3 实验方法 | 第113-117页 |
8.3.1 lnc-HC核心启动子区结合TFs的预测 | 第113-114页 |
8.3.2 ChIP验证预测TFs在lnc-HC启动子区的结合位点 | 第114-115页 |
8.3.3 TFs结合位点点突变实验 | 第115-116页 |
8.3.4 C/EBPβ高表达/敲低对lnc-HC核心启动子转录活性的影响 | 第116-117页 |
8.3.5 LXRα激动剂对C/EBPβ和lnc-HC表达水平的影响 | 第117页 |
8.3.6 统计学分析 | 第117页 |
8.4 实验结果 | 第117-121页 |
8.4.1 lnc-HC核心启动子区结合TFs的预测结果 | 第117-118页 |
8.4.2 ChIP证实C/EBPβ参与胆固醇上调lnc-HC的调控过程 | 第118页 |
8.4.3 胆固醇对lnc-HC启动子突变体的活性影响 | 第118-119页 |
8.4.4 C/EBPβ调节lnc-HC核心启动子的转录活性 | 第119-120页 |
8.4.5 LXRα激动剂上调C/EBPβ和lnc-HC的表达水平 | 第120-121页 |
8.5 讨论 | 第121-123页 |
9 结论与展望 | 第123-125页 |
9.1 结论 | 第123-124页 |
9.2 展望 | 第124-125页 |
致谢 | 第125-126页 |
参考文献 | 第126-135页 |
攻读学位期间取得的研究成果 | 第135-138页 |