| 本研究的主要创新点 | 第5-9页 |
| 摘要 | 第9-11页 |
| ABSTRACT | 第11-12页 |
| 缩略语表 | 第13-16页 |
| 第一章 前言 | 第16-64页 |
| 1.1 极端环境微生物(extremophiles) | 第16-20页 |
| 1.1.1 极端环境微生物的定义与分类 | 第16-17页 |
| 1.1.2 极端环境微生物的应用 | 第17-20页 |
| 1.2 极端嗜热微生物(hyperthermophiles) | 第20-24页 |
| 1.2.1 极端嗜热微生物 | 第20-22页 |
| 1.2.2 极端嗜热微生物的分离 | 第22-23页 |
| 1.2.3 极端嗜热微生物的代谢类型 | 第23-24页 |
| 1.3 极端嗜热微生物的高温适应机制 | 第24-29页 |
| 1.3.1 代谢产物和辅酶的高温适应机制 | 第25-26页 |
| 1.3.2 细胞膜的高温适应机制 | 第26-28页 |
| 1.3.3 核酸分子的高温适应机制 | 第28-29页 |
| 1.4 极端嗜热蛋白质(hyperthermophilic proteins) | 第29-44页 |
| 1.4.1 蛋白质的变性和降解(denaturation and degradation) | 第29-32页 |
| 1.4.2 极端嗜热蛋白质的高温适应机制 | 第32-44页 |
| 1.5 极端嗜热酶和极端嗜热微生物的应用 | 第44-47页 |
| 1.6 S层(surface layer)及S层蛋白(S-layer protein) | 第47-51页 |
| 1.6.1 S层及S层蛋白的基本性质 | 第47-50页 |
| 1.6.2 S层的功能和S层蛋白的应用 | 第50-51页 |
| 1.7 枯草杆菌蛋白酶类丝氨酸蛋白酶(subtilase) | 第51-54页 |
| 1.7.1 蛋白酶 | 第51-53页 |
| 1.7.2 枯草杆菌蛋白酶类丝氨酸蛋白酶（subtilisin-like serine protease,subtilase) | 第53-54页 |
| 1.8 极端嗜热蛋白酶pyrolysin | 第54-62页 |
| 1.8.1 极端嗜热古生菌Pyrococcusfuriosus | 第54-56页 |
| 1.8.2 极端嗜热蛋白酶pyrolysin | 第56-62页 |
| 1.9 本研究的目的、内容及意义 | 第62-64页 |
| 第二章 材料与方法 | 第64-88页 |
| 2.1 材料 | 第64-72页 |
| 2.1.1 菌株及质粒 | 第64-68页 |
| 2.1.2 药品及试剂 | 第68-69页 |
| 2.1.3 培养基及溶液的配制 | 第69-72页 |
| 2.1.4 仪器 | 第72页 |
| 2.2 方法 | 第72-88页 |
| 2.2.1 质粒DNA的制备 | 第72-73页 |
| 2.2.2 琼脂糖凝胶电泳 | 第73页 |
| 2.2.3 重组质粒的构建 | 第73-77页 |
| 2.2.4 质粒(连接产物或酶切产物)转化大肠杆菌感受态细胞 | 第77-78页 |
| 2.2.5 重组蛋白在大肠杆菌中诱导表达 | 第78页 |
| 2.2.6 重组蛋白的获得及纯化 | 第78-79页 |
| 2.2.7 重组蛋白的纯化 | 第79-80页 |
| 2.2.8 透析 | 第80-81页 |
| 2.2.9 蛋白质电泳 | 第81-82页 |
| 2.2.10 蛋白质浓度的测定 | 第82页 |
| 2.2.11 多克隆抗体的制备 | 第82-83页 |
| 2.2.12 Western-blot | 第83-84页 |
| 2.2.13 蛋白酶活性的测定 | 第84-85页 |
| 2.2.14 温度对蛋白酶活性影响的分析 | 第85页 |
| 2.2.15 蛋白酶稳定性的分析 | 第85-86页 |
| 2.2.16 温度对蛋白酶酶促反应初速度的影响 | 第86页 |
| 2.2.17 蛋白质N端测序样品的制备 | 第86-88页 |
| 第三章 金属离子对pyrolysin性质的影响 | 第88-104页 |
| 3.1 重组pyrolysin的加工、成熟的基本条件确定 | 第88-93页 |
| 3.1.1 重组pyrolysin的表达 | 第89-90页 |
| 3.1.2 酶原Pls的加工、成熟 | 第90-93页 |
| 3.2 金属离子对重组pyrolysin加工成熟过程的影响 | 第93-95页 |
| 3.3 金属离子对pyrolysin成熟酶活性及稳定性的影响 | 第95-98页 |
| 3.4 讨论 | 第98-102页 |
| 3.4.1 金属离子对pyrolysin的变性作用 | 第98-99页 |
| 3.4.2 金属离子对pyrolysin的稳定作用 | 第99-100页 |
| 3.4.3 金属离子对pyrolysin酶活性的促进作用 | 第100页 |
| 3.4.4 与pyrolysin稳定性及活性相关的其他因素? | 第100-102页 |
| 3.5 本章小结 | 第102-104页 |
| 第四章 Pyrolysin中Ca~(2+)结合位点的功能 | 第104-124页 |
| 4.1 Pyrolysin的Ca1位点的功能 | 第105-109页 |
| 4.1.1 Ca1位点突变体的构建 | 第105-106页 |
| 4.1.2 Ca1位点突变体与野生型的性质比较 | 第106-109页 |
| 4.2 Pyrolysin的Ca2位点的功能 | 第109-113页 |
| 4.2.1 Ca2位点突变体的构建 | 第109-110页 |
| 4.2.2 Ca2位点突变体与野生型的性质比较 | 第110-113页 |
| 4.3 Ca2位点中Asp→Asn突变的作用及机制 | 第113-116页 |
| 4.3.1 野生型(WT)与突变体(D818N/D820N)成熟酶性质的比较 | 第113-115页 |
| 4.3.2 WT与D818N/D820N成熟酶对Ca~(2+)亲和力的比较 | 第115-116页 |
| 4.4 Ca2位点对C端延伸区与催化功能区相互作用的影响 | 第116-119页 |
| 4.5 讨论 | 第119-123页 |
| 4.5.1 Pyrolysin的Ca1位点的组成与功能 | 第119-120页 |
| 4.5.2 Pyrolysin的Ca2位点的组成与功能 | 第120-121页 |
| 4.5.3 突变体(D818N/D820N)成熟酶的热稳定性增强的机制 | 第121-123页 |
| 4.6 本章小结 | 第123-124页 |
| 第五章 S层蛋白对pyrolysin性质的影响 | 第124-140页 |
| 5.1 重组S层蛋白的制备 | 第124-125页 |
| 5.2 S1蛋白对酶原Pls加工成熟过程的影响 | 第125-133页 |
| 5.2.1 S1蛋白对酶原Pls成熟效率的影响 | 第125-127页 |
| 5.2.2 S1蛋白在酶原Pls折叠和加工过程中的作用 | 第127-129页 |
| 5.2.3 S1蛋白的分子结构特征与其促进酶原Pls折叠的相关性 | 第129-131页 |
| 5.2.4 S1蛋白在不同缓冲液中对酶原Pls成熟效率的影响 | 第131-133页 |
| 5.3 S1蛋白对pyrolysin成熟酶热稳定性的影响 | 第133-136页 |
| 5.4 讨论 | 第136-138页 |
| 5.5 本章小结 | 第138-140页 |
| 全文总结及研究展望 | 第140-142页 |
| 附录 | 第142-144页 |
| 参考文献 | 第144-158页 |
| 在读期间发表的论文 | 第158-160页 |
| 致谢 | 第160页 |
