| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 英文缩略语及中文对照 | 第7-12页 |
| 1 前言 | 第12-27页 |
| 1.1 冷诱导金针菇原基形成研究进展 | 第12-16页 |
| 1.1.1 金针菇产业概述 | 第12-13页 |
| 1.1.2 金针菇原基形成研究进展 | 第13-15页 |
| 1.1.3 金针菇基因工程研究进展 | 第15-16页 |
| 1.2 组氨酸激酶研究进展 | 第16-18页 |
| 1.2.1 双组分信号传导系统 | 第16-17页 |
| 1.2.2 组氨酸激酶 | 第17-18页 |
| 1.3 GATA-Zinc finger转录因子研究进展 | 第18-19页 |
| 1.4 CRISPR/Cas9系统研究进展 | 第19-25页 |
| 1.4.1 CRISPR/Cas的结构及分类 | 第19-21页 |
| 1.4.2 CRISPR/Cas9的作用原理 | 第21-23页 |
| 1.4.3 CRISPR/Cas9技术的优势 | 第23-24页 |
| 1.4.4 CRISPR/Cas9在基因敲除中的应用 | 第24-25页 |
| 1.4.4.1 CRISPR/Cas9在植物基因敲除中的应用 | 第24-25页 |
| 1.4.4.2 CRISPR/Cas9在人类基因敲除中的应用 | 第25页 |
| 1.5 研究的目的与意义 | 第25-26页 |
| 1.6 技术路线 | 第26-27页 |
| 2 材料与方法 | 第27-49页 |
| 2.1 材料与试剂 | 第27-30页 |
| 2.1.1 质粒 | 第27页 |
| 2.1.2 菌株 | 第27页 |
| 2.1.3 试剂 | 第27-28页 |
| 2.1.4 仪器和设备 | 第28页 |
| 2.1.5 主要试剂配制 | 第28-30页 |
| 2.2 方法 | 第30-49页 |
| 2.2.1 金针菇菌丝和原基的收集 | 第30页 |
| 2.2.1.1 菌丝的收集 | 第30页 |
| 2.2.1.2 原基的收集 | 第30页 |
| 2.2.2 RNA提取和转录组测序 | 第30页 |
| 2.2.3 靶向基因的sgRNA的设计 | 第30-31页 |
| 2.2.4 引物设计 | 第31-32页 |
| 2.2.5 表达载体pgfvs-Cas9的构建 | 第32-37页 |
| 2.2.5.1 Cas9蛋白基因的扩增 | 第32页 |
| 2.2.5.2 重组质粒的构建 | 第32-33页 |
| 2.2.5.3 连接产物的转化 | 第33-35页 |
| 2.2.5.4 重组质粒的SpeⅠ和BsrGⅠ双酶切鉴定 | 第35-36页 |
| 2.2.5.5 序列分析 | 第36-37页 |
| 2.2.6 表达载体pHK1-gRNA的构建 | 第37-41页 |
| 2.2.6.1 三个片段的扩增 | 第37-39页 |
| 2.2.6.2 三个片段的回收 | 第39-40页 |
| 2.2.6.3 三个片段的融合 | 第40页 |
| 2.2.6.4 序列分析 | 第40-41页 |
| 2.2.7 表达载体pHK2-gRNA的构建 | 第41页 |
| 2.2.8 表达载体pZf-gRNA的构建 | 第41页 |
| 2.2.9 表达载体pgfvs-Cas9-HK1-gRNA的构建 | 第41-44页 |
| 2.2.9.1 载体pgfvs-Cas9线性化 | 第41页 |
| 2.2.9.2 片段H1-HK1-gRNA-hph的扩增 | 第41-42页 |
| 2.2.9.3 质粒T-H1-HK1-gRNA-hph的单酶切 | 第42页 |
| 2.2.9.4 酶切产物的连接 | 第42页 |
| 2.2.9.5 重组质粒的筛选 | 第42-43页 |
| 2.2.9.6 重组质粒的单酶切鉴定 | 第43-44页 |
| 2.2.9.7 序列分析 | 第44页 |
| 2.2.10 表达载体pgfvs-Cas9-HK2-gRNA的构建 | 第44页 |
| 2.2.11 金针菇原生质体的制备与再生 | 第44页 |
| 2.2.12 金针菇原生质体单核化 | 第44-45页 |
| 2.2.13 金针菇单核菌株出菇实验 | 第45页 |
| 2.2.14 金针菇菌丝体对潮霉素最低敏感浓度 | 第45页 |
| 2.2.15 金针菇原生质体对潮霉素最低敏感浓度 | 第45页 |
| 2.2.16 PEG法介导的金针菇原生质体转化 | 第45-46页 |
| 2.2.16.1 两个载体的共转化 | 第45-46页 |
| 2.2.16.2 一个载体的共转化 | 第46页 |
| 2.2.17 拟转化子的筛选 | 第46页 |
| 2.2.18 金针菇转化子的转接与保存 | 第46页 |
| 2.2.19 PCR鉴定金针菇拟转化子 | 第46-49页 |
| 2.2.19.1 拟转化子基因组DNA的提取 | 第46-47页 |
| 2.2.19.2 拟转化子的PCR鉴定 | 第47-49页 |
| 3 结果与分析 | 第49-70页 |
| 3.1 金针菇转录组数据分析 | 第49-51页 |
| 3.1.1 金针菇菌丝与原基的收集 | 第49-50页 |
| 3.1.2 转录组数据分析 | 第50-51页 |
| 3.2 表达载体的构建 | 第51-60页 |
| 3.2.1 表达载体pgfvs-Cas9的构建 | 第51-53页 |
| 3.2.2 表达载体pHK1-gRNA的构建 | 第53-54页 |
| 3.2.3 表达载体pHK2-gRNA的构建 | 第54-55页 |
| 3.2.4 表达载体pZf-gRNA的构建 | 第55页 |
| 3.2.5 表达载体pgfvs-Cas9-HK1-gRNA的构建 | 第55-57页 |
| 3.2.6 表达载体pgfvs-Cas9-HK2-gRNA的构建 | 第57-60页 |
| 3.3 金针菇转化结果分析 | 第60-70页 |
| 3.3.1 金针菇原生质体的制备 | 第60页 |
| 3.3.2 金针菇原生质体单核化 | 第60-61页 |
| 3.3.3 金针菇单核出菇 | 第61-62页 |
| 3.3.4 金针菇菌丝体对潮霉素的最低敏感浓度 | 第62-63页 |
| 3.3.5 金针菇原生质体对潮霉素的最低敏感浓度 | 第63页 |
| 3.3.6 PEG法转化金针菇原生质体 | 第63-65页 |
| 3.3.6.1 两个载体共转化原生质体 | 第63-64页 |
| 3.3.6.2 一个载体转化原生质体 | 第64-65页 |
| 3.3.7 拟转化子PCR鉴定 | 第65-70页 |
| 3.3.7.1 两个载体共转化的鉴定 | 第65-68页 |
| 3.3.7.2 一个载体转化的鉴定 | 第68-70页 |
| 4 讨论与结论 | 第70-79页 |
| 4.1 影响转录组测序材料收集的因素 | 第70-71页 |
| 4.2 CRISPR/Cas9系统应用于食用菌的可行性分析 | 第71-72页 |
| 4.3 提高转化率方法的探讨 | 第72-73页 |
| 4.3.1 转化方法的影响 | 第72-73页 |
| 4.3.2 载体类型的影响 | 第73页 |
| 4.4 CRISPR/Cas9系统检测方法的探讨 | 第73-74页 |
| 4.5 敲除效率的影响因素 | 第74-78页 |
| 4.5.1 Cas9密码子的优化的探讨 | 第74-75页 |
| 4.5.2 启动子的选择探讨 | 第75-76页 |
| 4.5.3 靶位点的设计问题的探讨 | 第76-77页 |
| 4.5.4 CRISPR/Cas9系统作用验证的探讨 | 第77-78页 |
| 4.6 结论 | 第78-79页 |
| 致谢 | 第79-80页 |
| 参考文献 | 第80-88页 |
| 附录 A | 第88-89页 |
| 附录 B | 第89-94页 |
