| 摘要 | 第2-3页 |
| Abstract | 第3-4页 |
| 1 前言 | 第10-15页 |
| 1.1 MiRNA的简介 | 第10页 |
| 1.2 MiRNA在肉鸡生长过程中发挥的作用 | 第10-12页 |
| 1.3 MiR-223的研究进展 | 第12-13页 |
| 1.4 MiR-223潜在靶基因IGF2和ZEB1的研究进展 | 第13-15页 |
| 1.5 研究目的和意义 | 第15页 |
| 2 材料与方法 | 第15-36页 |
| 2.1 实验材料 | 第15-18页 |
| 2.1.1 实验动物与细胞 | 第15-16页 |
| 2.1.2 主要试剂和配制 | 第16页 |
| 2.1.3 分子克隆实验需要的试剂及配制 | 第16-17页 |
| 2.1.4 细胞培养需要的试剂及配制 | 第17页 |
| 2.1.5 Western blot所需试剂及配制 | 第17-18页 |
| 2.1.6 主要仪器及设备 | 第18页 |
| 2.2 实验方法 | 第18-36页 |
| 2.2.1 鸡胚肌肉组织采样 | 第18页 |
| 2.2.2 组织DNA的抽提 | 第18-19页 |
| 2.2.3 鸡胚的性别鉴定 | 第19页 |
| 2.2.4 RNA抽提及检测 | 第19-20页 |
| 2.2.5 qRT-PCR检测miR-223在鸡胚肌肉发育过程中的表达变化 | 第20-22页 |
| 2.2.5.1 MiRNA的反转录 | 第20-21页 |
| 2.2.5.2 MiRNA的qPCR | 第21页 |
| 2.2.5.3 qPCR的数据分析处理 | 第21-22页 |
| 2.2.6 原代成肌细胞的分离培养和鉴定 | 第22-23页 |
| 2.2.6.1 原代成肌细胞的分离 | 第22页 |
| 2.2.6.2 原代成肌细胞的培养 | 第22页 |
| 2.2.6.3 原代成肌细胞的传代培养 | 第22页 |
| 2.2.6.4 原代成肌细胞的免疫荧光鉴定 | 第22-23页 |
| 2.2.7 鹌鹑成肌细胞系QM-7 的培养 | 第23页 |
| 2.2.8 qPCR检测成肌细胞增殖分化过程中miR-223的表达变化 | 第23-24页 |
| 2.2.9 MiR-223细胞生物学功能检测 | 第24-27页 |
| 2.2.9.1 细胞转染 | 第24页 |
| 2.2.9.2 成肌细胞的细胞周期检测 | 第24-25页 |
| 2.2.9.3 CCK-8试剂检测细胞增殖情况 | 第25页 |
| 2.2.9.4 qPCR检测肌肉分化的标记基因 | 第25-27页 |
| 2.2.10 MiR-223的靶标验证 | 第27-31页 |
| 2.2.10.1 靶基因的预测 | 第27页 |
| 2.2.10.2 双荧光素酶报告载体的构建 | 第27-30页 |
| 2.2.10.3 双荧光素酶报告载体的转染 | 第30-31页 |
| 2.2.10.4 双荧光素酶活性检测 | 第31页 |
| 2.2.11 qRT-PCR检测miR-223对靶基因mRNA水平的影响 | 第31-32页 |
| 2.2.12 Western Blot验证miR-223对靶基因蛋白水平的影响 | 第32-33页 |
| 2.2.12.1 Western Blot样品的自备 | 第32页 |
| 2.2.12.2 样品总蛋白定量 | 第32页 |
| 2.2.12.3 Western Blot基本步骤 | 第32-33页 |
| 2.2.13靶基因调控细胞增殖和细胞分化的验证 | 第33-36页 |
| 2.2.13.1 IGF2过表达载体的构建及鉴定 | 第33-34页 |
| 2.2.13.2 IGF2过表达载体的转染及检测 | 第34页 |
| 2.2.13.3 IGF2和ZEB1基因干扰片段的合成 | 第34-35页 |
| 2.2.13.4 siRNA干扰效率的检测 | 第35页 |
| 2.2.13.5 转染siRNA对细胞增殖分化的影响 | 第35-36页 |
| 3 结果和分析 | 第36-54页 |
| 3.1 MiR-223在鸡胚发育过程中的表达规律 | 第36-37页 |
| 3.1.1 鸡胚性别鉴定结果 | 第36页 |
| 3.1.2 肌肉组织总RNA抽提结果 | 第36-37页 |
| 3.1.3 MiR-223在鸡胚肌肉组织发育过程中的表达变化 | 第37页 |
| 3.2 成肌细胞体外诱导分化前后miR-223的表达变化 | 第37-40页 |
| 3.2.1 鸡胚成肌细胞的分离和鉴定 | 第37-38页 |
| 3.2.2 成肌细胞的增殖和诱导分化 | 第38-39页 |
| 3.2.3 qPCR检测成肌细胞诱导分化前后miR-223的表达 | 第39-40页 |
| 3.3 MiR-223在成肌细胞中的生物学功能 | 第40-44页 |
| 3.3.1 过表达和干扰miR-223的化学合成片段的转染效率检测 | 第40页 |
| 3.3.2 MiR-223抑制成肌细胞增殖 | 第40-41页 |
| 3.3.3 MiR-223阻滞成肌细胞的细胞周期 | 第41-42页 |
| 3.3.4 MiR-223促进成肌细胞分化 | 第42-44页 |
| 3.3.4.1 MiR-223促进成肌细胞分化标记基因的表达 | 第42-43页 |
| 3.3.4.2 MiR-223促进肌管的形成 | 第43-44页 |
| 3.4 MiR-223的靶标验证 | 第44-48页 |
| 3.4.1 野生型和突变型靶基因 3’UTR的双荧光素酶报告载体 | 第44-45页 |
| 3.4.2 双荧光素酶活性的检测 | 第45-46页 |
| 3.4.3 MiR-223与IGF2的靶标效应 | 第46-47页 |
| 3.4.4 MiR-223与ZEB1的靶标效应 | 第47-48页 |
| 3.5 IGF2促进成肌细胞的增殖和分化 | 第48-52页 |
| 3.5.1 IGF2过表达载体和siRNA的准备 | 第48-49页 |
| 3.5.2 IGF2促进成肌细胞增殖 | 第49-51页 |
| 3.5.3 IGF2促进成肌细胞的分化 | 第51-52页 |
| 3.6 ZEB1抑制成肌细胞的分化 | 第52-54页 |
| 3.6.1 siRNA干扰ZEB1基因的检测 | 第52页 |
| 3.6.2 ZEB1基因对成肌细胞增殖的作用 | 第52-53页 |
| 3.6.3 ZEB1抑制肌肉分化标记基因的表达 | 第53-54页 |
| 4 讨论 | 第54-59页 |
| 4.1 MiR-223在鸡胚发育中的表达规律 | 第54-55页 |
| 4.2 MiR-223的生物学意义 | 第55-57页 |
| 4.2.1 MiR-223对成肌细胞增殖的作用效果 | 第55-56页 |
| 4.2.2 MiR-223对成肌细胞分化的作用效果 | 第56-57页 |
| 4.2.3 MiR-223对家禽成肌细胞增殖分化的调控方式 | 第57页 |
| 4.3 IGF2与骨骼肌发育 | 第57-58页 |
| 4.4 ZEB1与骨骼肌发育 | 第58-59页 |
| 5 结论 | 第59-61页 |
| 致谢 | 第61-63页 |
| 参考文献 | 第63-71页 |
