| 摘要 | 第3-4页 |
| ABSTRACT | 第4-5页 |
| 常用缩略词 | 第6-10页 |
| 1 前言 | 第10-19页 |
| 1.1 动物性别控制技术的应用价值 | 第10页 |
| 1.2 动物性别控制技术的研究思路 | 第10-11页 |
| 1.3 动物性别控制技术的研究概况 | 第11-16页 |
| 1.3.1 X、Y精子分离 | 第11-12页 |
| 1.3.2 早期胚胎性别鉴定 | 第12页 |
| 1.3.3 妊娠选择 | 第12页 |
| 1.3.4 环境控制 | 第12-13页 |
| 1.3.5 类原始生殖细胞移植 | 第13-14页 |
| 1.3.6 动物体细胞克隆 | 第14-15页 |
| 1.3.7 Sry基因敲出敲入 | 第15-16页 |
| 1.3.8 RNA干扰技术 | 第16页 |
| 1.3.9 用核酸酶切割性染色体 | 第16页 |
| 1.4 Y染色体上的多拷贝基因 | 第16-17页 |
| 1.5 CRISPR/Cas9基因组编辑技术 | 第17页 |
| 1.6 研究目的和意义 | 第17-18页 |
| 1.7 研究技术路线 | 第18-19页 |
| 2 材料方法 | 第19-38页 |
| 2.1 材料 | 第19-22页 |
| 2.1.1 试验动物 | 第19页 |
| 2.1.2 菌种、质粒和细胞株 | 第19页 |
| 2.1.3 主要试剂及耗材 | 第19-20页 |
| 2.1.4 主要培养基和试剂的配制 | 第20-21页 |
| 2.1.5 主要仪器设备 | 第21页 |
| 2.1.6 结果统计与分析软件 | 第21-22页 |
| 2.2 注射抗小鼠Dby的si RNA对性别比例的影响 | 第22-29页 |
| 2.2.1 抗Dby sh RNA慢病毒表达载体的构建 | 第22页 |
| 2.2.2 293T、MC3T3-E1细胞的培养 | 第22-23页 |
| 2.2.3 慢病毒滴度检测 | 第23页 |
| 2.2.4 靶细胞的侵染 | 第23页 |
| 2.2.5 细胞RNA的抽提 | 第23-24页 |
| 2.2.6 RNA反转录及定量PCR | 第24-25页 |
| 2.2.7 小鼠受精卵、8 细胞期胚胎的收集 | 第25-27页 |
| 2.2.8 受精卵雄原核显微注射 | 第27页 |
| 2.2.9 胚胎移植 | 第27-28页 |
| 2.2.10 胚胎RNA抽提、反转录、定量 | 第28-29页 |
| 2.2.11 数据统计与分析 | 第29页 |
| 2.3 应用CRISPR/Cas9系统切割小鼠Y染色体对性别比例的影响 | 第29-38页 |
| 2.3.1 靶位点的选择 | 第29页 |
| 2.3.2 sgRNA表达载体及靶载体的构建 | 第29-31页 |
| 2.3.3 体外转录 | 第31-34页 |
| 2.3.4 MLTC-1、293T细胞共转染 | 第34-35页 |
| 2.3.5 细胞DNA抽提 | 第35页 |
| 2.3.6 DNA片段PCR扩增 | 第35-36页 |
| 2.3.7 切割效率检测 | 第36-38页 |
| 3 结果与分析 | 第38-62页 |
| 3.1 干扰小鼠胚胎Dby基因表达对性别比例的影响 | 第38-46页 |
| 3.1.1 靶位点的选择及sh RNA慢病毒表达载体的构建 | 第38-40页 |
| 3.1.2 sh RNA慢病毒表达载体侵染靶细胞 | 第40-42页 |
| 3.1.3 抗小鼠Dby的sh RNA筛选 | 第42-43页 |
| 3.1.4 注射si RNA对胚胎Dby mRNA抑制效果 | 第43-44页 |
| 3.1.5 注射si RNA对出生小鼠性别比例的影响 | 第44-45页 |
| 3.1.6 注射si RNA对雄性小鼠生殖能力的影响 | 第45-46页 |
| 3.2 应用CRISPR/Cas9系统切割小鼠Rbmy基因破坏Y染色体的研究 | 第46-62页 |
| 3.2.1 靶位点的选择 | 第46-47页 |
| 3.2.2 sgRNA表达载体的构建 | 第47-50页 |
| 3.2.3 Cas9 mRNA及sgRNA的体外转录 | 第50-51页 |
| 3.2.4 不同sgRNA介导Cas9在 293T细胞中切割靶载体效率的比较 | 第51-57页 |
| 3.2.5 不同sgRNA介导Cas9蛋白在试管中切割靶位点效率的比较 | 第57-59页 |
| 3.2.6 sgRNA6介导Cas9在MLTC-1 细胞中对Rbmy基因的切割效果 | 第59-61页 |
| 3.2.7 sgRNA6介导的Cas9在MLTC-1 细胞中的脱靶效应检测 | 第61-62页 |
| 4 讨论与结论 | 第62-67页 |
| 4.1 影响哺乳动物胚胎发育的因素 | 第62-63页 |
| 4.2 抑制Y染色体基因表达对雄性生殖能力的影响 | 第63-64页 |
| 4.3 CRISPR/Cas9系统对基因组DNA的切割 | 第64-66页 |
| 4.3.1 靶位点的选择 | 第64页 |
| 4.3.2 切割效率的不同检测方法 | 第64-65页 |
| 4.3.3 脱靶效率 | 第65-66页 |
| 4.4 结论 | 第66-67页 |
| 致谢 | 第67-69页 |
| 参考文献 | 第69-75页 |
