| 摘要 | 第5-7页 |
| abstract | 第7-9页 |
| 第1章 绪论 | 第12-18页 |
| 1.1 研究背景 | 第12-14页 |
| 1.1.1 磷脂酶简介 | 第12页 |
| 1.1.2 磷脂酶A1的生理功能与细胞毒性 | 第12页 |
| 1.1.3 磷脂酶A1的工业应用 | 第12-13页 |
| 1.1.4 磷脂酶A1的主要来源 | 第13页 |
| 1.1.5 磷脂酶A1的研究进展 | 第13-14页 |
| 1.2 大肠杆菌表达系统简介 | 第14-15页 |
| 1.2.1 大肠杆菌表达系统的主要优点 | 第14页 |
| 1.2.2 大肠杆菌表达系统中的质粒载体 | 第14-15页 |
| 1.2.3 外源基因在大肠杆菌中的表达 | 第15页 |
| 1.3 毕赤酵母表达系统简介 | 第15-16页 |
| 1.3.1 主要优点 | 第16页 |
| 1.3.2 毕赤酵母中表达系统中的质粒载体 | 第16页 |
| 1.3.3 外源基因在毕赤酵母中的表达 | 第16页 |
| 1.4 本课题的研究意义及内容 | 第16-18页 |
| 第2章 磷脂酶A1基因在大肠杆菌中的表达 | 第18-36页 |
| 2.1 实验材料与仪器 | 第18-21页 |
| 2.1.1 菌株和质粒 | 第18页 |
| 2.1.2 培养基和试剂 | 第18-20页 |
| 2.1.3 仪器 | 第20-21页 |
| 2.2 试验方法 | 第21-24页 |
| 2.2.1 粘质沙雷氏菌基因组提取 | 第21页 |
| 2.2.2 目的基因的扩增 | 第21-22页 |
| 2.2.3 大肠杆菌化学转化感受态的制备与转化 | 第22-23页 |
| 2.2.4 重组阳性克隆的筛选和鉴定 | 第23页 |
| 2.2.5 重组菌诱导酶活的初步测定及SDS-PAGE凝胶电泳检测 | 第23页 |
| 2.2.6 酶活测定方法与重组菌株生长曲线的测定 | 第23-24页 |
| 2.2.7 重组菌诱导产酶条件优化 | 第24页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第24-35页 |
| 2.3.1 磷脂酶A1基因的扩增 | 第24-25页 |
| 2.3.2 平板筛选与蛋白质检测 | 第25-26页 |
| 2.3.3 重组菌株生长曲线与酶活 | 第26-27页 |
| 2.3.4 AP22诱导产酶条件优化 | 第27-30页 |
| 2.3.5 AP22pLysS诱导产酶条件优化 | 第30-32页 |
| 2.3.6 AP28pLysS诱导产酶条件优化 | 第32-33页 |
| 2.3.7 正交实验 | 第33-35页 |
| 2.4 本章小结 | 第35-36页 |
| 第3章 磷脂酶A1+辅助蛋白基因(plaB)在大肠杆菌中表达 | 第36-47页 |
| 3.1 实验材料与仪器 | 第36页 |
| 3.2 试验方法 | 第36-38页 |
| 3.2.1 粘质沙雷氏菌基因组提取 | 第36页 |
| 3.2.2 目的基因的扩增 | 第36-37页 |
| 3.2.3 大肠杆菌化学转化感受态的制备与转化 | 第37-38页 |
| 3.2.4 重组阳性克隆的筛选和鉴定 | 第38页 |
| 3.2.5 重组菌SDS-PAGE凝胶电泳与酶活测定 | 第38页 |
| 3.2.6 重组菌株生长曲线的测定 | 第38页 |
| 3.2.7 重组菌诱导产酶条件的单因素优化 | 第38页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第38-45页 |
| 3.3.1 磷脂酶A1及其辅助蛋白基因(plaB)的扩增 | 第38-39页 |
| 3.3.2 重组质粒pET22b(+)-plaB的验证 | 第39页 |
| 3.3.3 重组菌平板筛选与蛋白质电泳 | 第39-41页 |
| 3.3.4 重组菌株生长曲线的测定 | 第41页 |
| 3.3.5 重组菌BP22pLysS诱导产酶条件优化 | 第41-43页 |
| 3.3.6 BP22诱导产酶条件优化 | 第43-44页 |
| 3.3.7 BP28pLysS诱导表达条件的优化 | 第44-45页 |
| 3.4 本章小结 | 第45-47页 |
| 第4章 磷脂酶A1基因在毕赤酵母中的表达 | 第47-60页 |
| 4.1 实验材料与仪器 | 第47-48页 |
| 4.1.1 菌株和质粒 | 第47页 |
| 4.1.2 培养基和试剂 | 第47-48页 |
| 4.1.3 仪器 | 第48页 |
| 4.2 试验方法 | 第48-51页 |
| 4.2.1 目的基因的扩增 | 第48-49页 |
| 4.2.2 重组阳性克隆的筛选和鉴定 | 第49页 |
| 4.2.3 毕赤酵母感受态的制备与电击转化 | 第49-50页 |
| 4.2.4 毕赤酵母阳性克隆的筛选 | 第50页 |
| 4.2.5 重组酵母摇瓶培养与条件优化 | 第50-51页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第51-58页 |
| 4.3.1 磷脂酶A1基因的扩增 | 第51页 |
| 4.3.2 重组载体pPPIC9K-plaA的构建 | 第51-52页 |
| 4.3.3 重组质粒线性化 | 第52-53页 |
| 4.3.4 毕赤酵母KM71的电击转化 | 第53页 |
| 4.3.5 毕赤酵母阳性克隆的筛选 | 第53-54页 |
| 4.3.6 重组表达菌的SDS-PAGE检验 | 第54-55页 |
| 4.3.7 P.pastoris KM71/pPIC9K-plaA摇瓶诱导表达条件优化 | 第55-58页 |
| 4.4 本章小结 | 第58-60页 |
| 第5章 结论与展望 | 第60-62页 |
| 5.1 结论 | 第60页 |
| 5.2 展望 | 第60-62页 |
| 攻读硕士期间发表论文 | 第62-63页 |
| 致谢 | 第63-64页 |
| 参考文献 | 第64-66页 |
