| 摘要 | 第5-7页 |
| ABSTRACT | 第7-8页 |
| 第1章 绪论 | 第12-25页 |
| 1.1 倍半萜内酯及其结构类型 | 第12-15页 |
| 1.2 倍半萜内酯的生物活性 | 第15-16页 |
| 1.3 倍半萜内酯的合成生物学研究 | 第16-23页 |
| 1.3.1 合成生物学 | 第16页 |
| 1.3.2 倍半萜碳骨架形成酶的研究进展 | 第16-19页 |
| 1.3.3 C12,6型倍半萜内酯生物合成研究进展 | 第19-21页 |
| 1.3.4 C12,8型倍半萜内酯生物合成研究进展 | 第21页 |
| 1.3.5 倍半萜内酯化合物生物合成途径的推测 | 第21-23页 |
| 1.3.5.1 C12,8型倍半萜内酯生物合成途径的推测 | 第21-22页 |
| 1.3.5.2 Eudesmanolide型倍半萜内酯生物合成途径的推测 | 第22-23页 |
| 1.4 拟解决的科学问题及课题意义 | 第23-25页 |
| 第2章 C12,8型倍半萜内酯环成环的分子机制 | 第25-97页 |
| 2.1 前言 | 第25-31页 |
| 2.2 材料和方法 | 第31-57页 |
| 2.2.1 植物材料 | 第31-32页 |
| 2.2.2 植物化学分析 | 第32-33页 |
| 2.2.3 线叶旋覆花花转录组文库构建 | 第33-34页 |
| 2.2.4 倍半萜内酯生物合成途径下游候选CYP71基因的挖掘 | 第34-35页 |
| 2.2.5 分子生物学实验方法 | 第35-45页 |
| 2.2.5.1 总RNA的提取及质量分析 | 第35-37页 |
| 2.2.5.2 cDNA第一链的合成 | 第37-38页 |
| 2.2.5.3 PCR的扩增 | 第38-39页 |
| 2.2.5.4 DNA的酶切反应 | 第39-40页 |
| 2.2.5.5 PCR产物或酶切产物的回收 | 第40页 |
| 2.2.5.6 DNA片段的连接 | 第40-41页 |
| 2.2.5.7 DH5α感受态细胞的制备及转化(CaCl_2法) | 第41-42页 |
| 2.2.5.8 质粒提取 | 第42-43页 |
| 2.2.5.9 酵母培养基的配制 | 第43-44页 |
| 2.2.5.10 酵母(WAT11和EPY300)感受态细胞制备及转化 | 第44-45页 |
| 2.2.6 旋覆花属植物中候选CYP71酶基因功能分析 | 第45-52页 |
| 2.2.6.1 旋覆花CYP71基因分离和载体构建 | 第45-46页 |
| 2.2.6.2 转基因酵母菌株的构建和培养 | 第46-47页 |
| 2.2.6.3 GC/MS分析 | 第47-48页 |
| 2.2.6.4 代谢物提取和LC-ESI-MS分析 | 第48页 |
| 2.2.6.5 Ih8H催化产物的纯化 | 第48-49页 |
| 2.2.6.6 GAA的制备 | 第49页 |
| 2.2.6.7 体外酶促活性试验 | 第49-50页 |
| 2.2.6.8 Km值测定 | 第50页 |
| 2.2.6.9 NMR(Nuclear Magnetic Resonance)分析 | 第50-51页 |
| 2.2.6.10 Ih8H催化内酯产物碱性开环试验 | 第51页 |
| 2.2.6.11 基因表达分析 | 第51页 |
| 2.2.6.12 茉莉酸甲酯诱导试验 | 第51-52页 |
| 2.2.7 苍耳属植物中候选CYP71酶基因功能分析 | 第52-57页 |
| 2.2.7.1 苍耳CYP71基因的克隆 | 第52页 |
| 2.2.7.2 CYP71酶活性中心分析 | 第52-54页 |
| 2.2.7.3 定点突变试验 | 第54-55页 |
| 2.2.7.4 In vivo活性分析 | 第55-56页 |
| 2.2.7.5 In vitro活性分析 | 第56页 |
| 2.2.7.6 系统进化树构建 | 第56-57页 |
| 2.3 实验结果与分析 | 第57-91页 |
| 2.3.1 转录组文库构建 | 第57-65页 |
| 2.3.1.1 研究部位的筛选 | 第57-60页 |
| 2.3.1.2 总RNA的质量分析结果 | 第60-61页 |
| 2.3.1.3 转录组de novo测序、组装和深度评估 | 第61-63页 |
| 2.3.1.4 Unigene功能注释及分类 | 第63-65页 |
| 2.3.2 候选CYP71基因的挖掘 | 第65-69页 |
| 2.3.2.1 旋覆花属植物中候选CYP71基因的筛选 | 第65-68页 |
| 2.3.2.2 苍耳属植物中候选CYP71基因的筛选 | 第68页 |
| 2.3.2.3 系统进化分析 | 第68-69页 |
| 2.3.3 旋覆花属植物中候选CYP71 (Ih8H)基因功能分析 | 第69-86页 |
| 2.3.3.1 生物合成GAA | 第69-70页 |
| 2.3.3.2 Ih8H酵母体内活性分析 | 第70-73页 |
| 2.3.3.3 Ih8H酶促产物(峰1)结构鉴定 | 第73-75页 |
| 2.3.3.4 12,8α型内酯Inunolide的成环机理 | 第75-79页 |
| 2.3.3.5 Ih8H体外活性分析 | 第79-81页 |
| 2.3.3.6 Ih8H基因表达与代谢物的积累分析 | 第81-84页 |
| 2.3.3.7 Ih8H基因和C12,8型倍半萜内酯对MeJA的响应 | 第84-86页 |
| 2.3.4 苍耳属植物中候选CYP71 (Xs8Hs)基因功能分析 | 第86-91页 |
| 2.3.4.1 自然群体苍耳中Xs8Hs基因的变异 | 第86页 |
| 2.3.4.2 定点突变结果 | 第86-87页 |
| 2.3.4.3 In vivo活性 | 第87-89页 |
| 2.3.4.4 In vitro活性 | 第89-91页 |
| 2.4 讨论 | 第91-95页 |
| 2.5 小结 | 第95-97页 |
| 第3章 桉烷型倍半萜内酯核心碳骨架形成的分子机制 | 第97-120页 |
| 3.1 前言 | 第97-100页 |
| 3.2 材料和方法 | 第100-107页 |
| 3.2.1 植物材料 | 第100页 |
| 3.2.2 湖北旋覆花叶中倍半萜烯成分检测 | 第100页 |
| 3.2.3 倍半萜合酶(TPSs)基因的克隆 | 第100-101页 |
| 3.2.4 原核表达载体和酵母表达载体的构建 | 第101页 |
| 3.2.5 标签融合蛋白的原核表达和纯化 | 第101-105页 |
| 3.2.5.1 His-tag融合蛋白纯化原理 | 第101-102页 |
| 3.2.5.2 缓冲液配制 | 第102页 |
| 3.2.5.3 融合蛋白诱导表达和纯化 | 第102-104页 |
| 3.2.5.4 SDS-PAGE | 第104-105页 |
| 3.2.6 体外酶促反应 | 第105-106页 |
| 3.2.7 IhsTPS1功能分析 | 第106页 |
| 3.2.8 柏烯醇(10-epi-Junenol)检测 | 第106页 |
| 3.2.9 IhsTPS1基因的表达特性分析 | 第106-107页 |
| 3.3 实验结果和讨论 | 第107-118页 |
| 3.3.1 湖北旋覆花嫩叶中倍半萜烯成分分析 | 第107-109页 |
| 3.3.2 倍半萜合酶基因的分离及序列分析 | 第109-110页 |
| 3.3.3 进化分析结果 | 第110-111页 |
| 3.3.4 表达载体构建 | 第111页 |
| 3.3.5 IhsTPS1功能分析 | 第111-116页 |
| 3.3.5.1 IhsTPS1蛋白诱导表达与纯化 | 第111-112页 |
| 3.3.5.2 IhsTPS1体外活性分析 | 第112-116页 |
| 3.3.5.3 IhsTPS1酵母体内活性分析 | 第116页 |
| 3.3.6 IhsTPS1基因表达与10-epi-junenol积累相关分析 | 第116-118页 |
| 3.4 小结 | 第118-120页 |
| 第4章 结论及展望 | 第120-123页 |
| 4.1 结论 | 第120页 |
| 4.2 研究创新点 | 第120-121页 |
| 4.3 展望 | 第121-123页 |
| 参考文献 | 第123-142页 |
| 附录 表A | 第142-145页 |
| 附录 图B | 第145-155页 |
| 致谢 | 第155-157页 |
| 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 | 第157-159页 |
