| 摘要 | 第1-6页 |
| ABSTRACT | 第6-8页 |
| 缩略语 | 第8-13页 |
| 第一章 绪论 | 第13-17页 |
| 1 杆状病毒研究现状 | 第13-15页 |
| ·杆状病毒简介 | 第13页 |
| ·杆状病毒调控基因研究概况 | 第13-14页 |
| ·家蚕杆状病毒表达系统简介 | 第14-15页 |
| 2 Red同源重组技术 | 第15-16页 |
| 3 双萤光素酶报告基因简介 | 第16-17页 |
| 第二章 实验方案 | 第17-19页 |
| 1 研究的目的和意义 | 第17页 |
| 2 研究的主要内容 | 第17-18页 |
| 3 技术路线 | 第18-19页 |
| 第三章 家蚕杆状病毒多角体启动子结合蛋白的筛选 | 第19-41页 |
| 1 材料与试剂 | 第19-20页 |
| ·材料 | 第19页 |
| ·试剂 | 第19-20页 |
| ·试剂配制 | 第20页 |
| 2 方法 | 第20-33页 |
| ·双萤光素酶载体的构建 | 第20-26页 |
| ·重组转移载体p Fast Bac Dual-A3-Rluc的构建 | 第21-24页 |
| ·家蚕细胞基因组的提取 | 第21页 |
| ·重组转移载体p Fast Bac Dual-A3的构建 | 第21-23页 |
| ·重组转移载体p Fast Bac Dual-A3-Rluc的构建 | 第23页 |
| ·重组转移载体p Fast Bac Dual-A3-Rluc-polh-Fluc的构建 | 第23-24页 |
| ·双萤光素病毒载体wt-Bacmid-A3-Rluc-polh-Fluc的构建 | 第24-26页 |
| ·DH10Bac感受态细胞的制备 | 第24页 |
| ·供体质粒p Fast Bac Dual-A3-Rluc-polh-Fluc的转化 | 第24-25页 |
| ·双萤光素病毒载体wt-Bacmid-A3-Rluc-polh-Fluc的鉴定 | 第25-26页 |
| ·目的蛋白过表达载体的构建 | 第26-28页 |
| ·重组过表达载体的构建 | 第26-27页 |
| ·Western blotting检测筛选蛋白在家蚕细胞中过表达 | 第27-28页 |
| ·目的蛋白过表达对Bm NPV多角体启动子转录调控 | 第28-29页 |
| ·脂质体介导的过表达载体转染家蚕细胞 | 第28-29页 |
| ·双萤光素酶活性检测 | 第29页 |
| ·39k、lef5、orf61基因缺失型双萤光素酶病毒载体的构建 | 第29-32页 |
| ·p KD46质粒提取 | 第29-30页 |
| ·p KD46质粒的转化 | 第30页 |
| ·含p KD46的DH10Bac感受态的制备 | 第30页 |
| ·39k、lef5、orf61基因打靶片段的制备 | 第30-31页 |
| ·39k、lef5、orf61基因缺失型双萤光素酶病毒载体的构建 | 第31页 |
| ·39k、lef5、orf61基因缺失型双萤光素酶病毒载体的鉴定 | 第31-32页 |
| ·39k、lef5、orf61基因缺失对Bm NPV多角体启动子转录调控 | 第32-33页 |
| ·脂质体介导的敲除型Bacmid-A3-Rluc-polh-Fluc转染家蚕细胞 | 第32页 |
| ·双萤光素酶活性检测 | 第32-33页 |
| 3 结果与分析 | 第33-39页 |
| ·重组转移载体p Fast Bac Dual-A3-Rluc-polh-Fluc的PCR鉴定 | 第33-34页 |
| ·双萤光素病毒载体wt-Bacmid-A3-Rluc-polh-Fluc的PCR鉴定 | 第34页 |
| ·过表达载体的PCR鉴定 | 第34-35页 |
| ·目的蛋白过表达的Western blotting分析 | 第35-36页 |
| ·目的蛋白过表达对Bm NPV多角体启动子转录调控 | 第36-37页 |
| ·39k、lef5、orf61基因缺失型双萤光素酶病毒载体的鉴定 | 第37-38页 |
| ·39k、lef5、orf61基因缺失对Bm NPV多角体启动子转录调控 | 第38-39页 |
| 4 讨论 | 第39-41页 |
| 第四章 家蚕杆状病毒 39k基因功能研究 | 第41-61页 |
| 1 材料与试剂 | 第41-42页 |
| ·材料 | 第41页 |
| ·试剂 | 第41页 |
| ·试剂配制 | 第41-42页 |
| 2 方法 | 第42-49页 |
| ·39k基因的序列分析 | 第42页 |
| ·39k基因的转录时相 | 第42-43页 |
| ·家蚕细胞的复苏及培养 | 第42页 |
| ·Bm NPV病毒感染Bm N细胞的总RNA的提取 | 第42-43页 |
| ·c DNA第一链的合成 | 第43页 |
| ·39k基因的转录时相 | 第43页 |
| ·39k基因缺失型和修复型病毒的构建 | 第43-45页 |
| ·39k基因缺失型Bacmid的构建 | 第43-44页 |
| ·39k基因修复型Bacmid的构建 | 第44-45页 |
| ·转移载体p Fast Bac- 39k的构建 | 第44页 |
| ·39k基因修复型Bacmid的构建 | 第44-45页 |
| ·39k基因缺失对Bm NPV病毒滴度的影响 | 第45-46页 |
| ·碱裂解法提取重组Bacmid | 第45页 |
| ·重组Bacmid转染家蚕细胞 | 第45页 |
| ·病毒滴度的测定 | 第45-46页 |
| ·39k基因缺失对Bm NPV病毒基因组复制情况检测 | 第46-48页 |
| ·Bm NPV病毒基因组的提取 | 第46-47页 |
| ·q PCR检测Bm NPV病毒基因组复制情况 | 第47页 |
| ·q PCR标准曲线的绘制 | 第47页 |
| ·q PCR检测Bm NPV病毒基因组复制情况 | 第47-48页 |
| ·39k基因缺失对Bm NPV基因转录的影响 | 第48-49页 |
| ·重组Bacmid转染家蚕细胞 | 第48页 |
| ·Bm NPV病毒感染Bm N细胞的总RNA的提取及c DNA制备 | 第48页 |
| ·q PCR检测 39k基因缺失对Bm NPV各时期基因转录的影响 | 第48-49页 |
| 3 结果与分析 | 第49-59页 |
| ·39k基因序列分析 | 第49-50页 |
| ·39K蛋白氨基酸同源性比对 | 第50-52页 |
| ·39k基因的转录时相 | 第52页 |
| ·39k基因缺失型Bacmid的鉴定 | 第52-53页 |
| ·39k基因修复型Bacmid的鉴定 | 第53-54页 |
| ·39k基因缺失型Bm NPV感染细胞的情况 | 第54-55页 |
| ·39k基因缺失对Bm NPV病毒滴度的影响 | 第55-56页 |
| ·39k基因缺失对Bm NPV基因组复制的影响 | 第56-57页 |
| ·39k基因缺失对Bm NPV基因转录的影响 | 第57-59页 |
| 4 讨论 | 第59-61页 |
| 结论 | 第61-62页 |
| 参考文献 | 第62-67页 |
| 附录 | 第67-69页 |
| 致谢 | 第69页 |
