| 论文创新点 | 第1-14页 |
| 摘要 | 第14-16页 |
| Abstract | 第16-19页 |
| 研究意义 | 第19-20页 |
| 技术路线 | 第20-21页 |
| 第一部分 文献综述 | 第21-53页 |
| 第一章 狂犬病毒及其致病机制研究进展 | 第21-35页 |
| 1. RV基因组结构及编码蛋白的功能 | 第21-27页 |
| ·糖蛋白(G) | 第21-23页 |
| ·核蛋白(N) | 第23页 |
| ·磷蛋白(P) | 第23-25页 |
| ·基质蛋白(M) | 第25-26页 |
| ·RNA依赖性RNA聚合酶(L) | 第26-27页 |
| 2. RV的复制、转录和蛋白表达策略 | 第27-29页 |
| 3. RV的致病机理 | 第29-35页 |
| ·RV是否通过血液入侵中枢神经系统? | 第30-31页 |
| ·神经功能障碍 | 第31-32页 |
| ·病毒通过引起细胞凋亡或坏死的方式引起细胞死亡 | 第32-33页 |
| ·RV的免疫逃避策略 | 第33页 |
| ·与神经元突起有关的新观点 | 第33-35页 |
| 第二章 蛋白质组学及其在病毒学研究中的应用 | 第35-46页 |
| 1 蛋白质组学 | 第35-39页 |
| ·概念 | 第35-36页 |
| ·蛋白组学分类 | 第36-38页 |
| ·蛋白质组学研究的技术手段 | 第38-39页 |
| 2 比较蛋白质组学常用的分离和鉴定技术 | 第39-42页 |
| ·二维凝胶电泳(2-DE)和二维差异凝胶电泳(2D-DIGE) | 第39-40页 |
| ·MS/MS | 第40页 |
| ·SILAC | 第40-41页 |
| ·LC-MS/MS | 第41页 |
| ·ICAT | 第41页 |
| ·蛋白质芯片 | 第41-42页 |
| 3 蛋白质组学在病毒学研究领域中的应用 | 第42-46页 |
| ·病毒感染造成宿主细胞蛋白表达模式的变化 | 第42-43页 |
| ·病毒药物治疗靶标的寻找 | 第43-44页 |
| ·研究病毒粒子的蛋白组成 | 第44页 |
| ·分析病毒基因表达调控及其与宿主蛋白的相互作用 | 第44-46页 |
| 第三章 真核细胞伴侣素的研究进展 | 第46-53页 |
| 1. 分子伴侣的定义及分类 | 第46-47页 |
| 2. 伴侣素家族(chaperonin,Cpn) | 第47页 |
| 3. 伴侣素的结构与环状排列 | 第47-48页 |
| 4. 核苷酸与CCT的结合及蛋白折叠 | 第48-49页 |
| 5. 伴侣素在肌动蛋白和微管蛋白上的识别位点 | 第49-50页 |
| 6. 伴侣素与上游蛋白陪伴分子的协作 | 第50-51页 |
| 7. 蛋白错误折叠病与伴侣素 | 第51-52页 |
| 8. 伴侣素在病毒感染中的作用 | 第52-53页 |
| 第二部分 研究内容 | 第53-137页 |
| 第一章 抗狂犬病毒单克隆抗体的制备及鉴定 | 第53-73页 |
| 摘要 | 第53-54页 |
| 1. 材料 | 第54-55页 |
| ·主要仪器与器材 | 第54页 |
| ·实验动物及细胞 | 第54页 |
| ·毒株、载体和菌株 | 第54页 |
| ·分子生物学试剂 | 第54页 |
| ·试剂与药品 | 第54-55页 |
| ·试剂配制 | 第55页 |
| 2. 方法 | 第55-61页 |
| ·免疫抗原的制备 | 第55-56页 |
| ·动物免疫 | 第56-57页 |
| ·抗血清的分离 | 第57页 |
| ·细胞融合 | 第57页 |
| ·阳性细胞株的筛选 | 第57-58页 |
| ·阳性杂交瘤细胞株的亚克隆 | 第58页 |
| ·单抗腹水制备 | 第58-59页 |
| ·单克隆抗体特性鉴定 | 第59-60页 |
| ·真核表达载体pCI-neo-P的构建 | 第60-61页 |
| 3. 结果 | 第61-69页 |
| ·单抗细胞的建株 | 第61页 |
| ·抗N单抗与狂犬病毒ERA株感染Vero细胞的反应性 | 第61-62页 |
| ·抗N及G单抗腹水ELISA效价及亚型鉴定 | 第62-63页 |
| ·抗N单抗的免疫印迹实验 | 第63页 |
| ·抗RV单抗对病毒的识别情况 | 第63-65页 |
| ·抗RV单抗腹水IFA效价 | 第65页 |
| ·亚型鉴定 | 第65-66页 |
| ·19株抗RV单抗的Dot-blot反应性 | 第66-67页 |
| ·Western-blot结果 | 第67页 |
| ·中和抗体的鉴定结果 | 第67页 |
| ·交叉反应情况 | 第67-68页 |
| ·P基因片段的扩增 | 第68-69页 |
| ·P基因真核表达载体的构建 | 第69页 |
| ·P蛋白在成神经瘤细胞中的表达及单抗鉴定 | 第69页 |
| 4. 讨论 | 第69-73页 |
| ·核蛋白的抗原性 | 第69-70页 |
| ·糖蛋白的免疫效果 | 第70页 |
| ·乳鼠脑组织悬液RV病毒抗原的免疫效果 | 第70-72页 |
| ·抗体对Flury毒株的交叉反应情况 | 第72-73页 |
| 第二章 狂犬病毒感染的成神经瘤细胞差异蛋白质组学研究 | 第73-114页 |
| 摘要 | 第73-74页 |
| 1. 材料与方法 | 第74-84页 |
| ·细胞与病毒 | 第74-75页 |
| ·仪器和软件 | 第75页 |
| ·试剂和药品 | 第75页 |
| ·抗体 | 第75页 |
| ·二维电泳样品制备 | 第75-76页 |
| ·二维凝胶电泳 | 第76-78页 |
| ·凝胶染色 | 第78页 |
| ·图像扫描和PDQuest软件的使用 | 第78-79页 |
| ·差异蛋白点的挖取 | 第79页 |
| ·蛋白点的质谱鉴定和数据库检索 | 第79-82页 |
| ·蛋白-蛋白相互作用网络的构建 | 第82页 |
| ·实时荧光定量PCR验证 | 第82-83页 |
| ·免疫印迹验证 | 第83页 |
| ·病毒滴度测定 | 第83-84页 |
| 2、结果 | 第84-108页 |
| ·样品的制备与验证 | 第84-86页 |
| ·N2a细胞二维电泳方法的建立 | 第86页 |
| ·狂犬病毒感染N2a细胞的2DE差异表达背景 | 第86-87页 |
| ·RV感染N2a细胞的差异表达分析 | 第87-90页 |
| ·差异蛋白的质谱鉴定 | 第90-101页 |
| ·差异表达蛋白的分类 | 第101-102页 |
| ·RV感染N2a细胞差异表达蛋白相互作用网络的构建 | 第102-104页 |
| ·差异表达蛋白的转录本分析 | 第104-105页 |
| ·差异表达蛋白的免疫印迹分析(WB)验证 | 第105-108页 |
| 3 讨论 | 第108-113页 |
| ·RV感染对细胞能量代谢的影响 | 第108-109页 |
| ·细胞骨架蛋白的变化 | 第109-110页 |
| ·RNA的加工与生物合成 | 第110-111页 |
| ·病毒感染与热休克蛋白、蛋白折叠相关蛋白的表达 | 第111-112页 |
| ·免疫相关蛋白的表达 | 第112-113页 |
| 4 本章小结 | 第113-114页 |
| 第三章 宿主蛋白伴侣素TRiC/CCT在狂犬病毒感染细胞中的功能分析 | 第114-137页 |
| 摘要 | 第114-115页 |
| 1 材料和方法 | 第115-119页 |
| ·质粒、抗体与试剂 | 第115-116页 |
| ·病毒制备与细胞培养 | 第116页 |
| ·抗N兔多抗血清的制备 | 第116页 |
| ·狂犬病毒N、P蛋白真核表达载体的构建 | 第116-117页 |
| ·真核表达载体转染 | 第117页 |
| ·荧光双标染色及核染 | 第117-118页 |
| ·慢病毒介导CCTγ和CCTα的RNA干扰 | 第118页 |
| ·CCT基因的RNA干扰对RV复制的影响 | 第118页 |
| ·实时荧光定量PCR | 第118-119页 |
| 2 结果 | 第119-134页 |
| ·伴侣素TRiC/CCT在感染细胞中的亚细胞分布变化 | 第119-121页 |
| ·分子伴侣HSP90在感染细胞中的亚细胞分布 | 第121-122页 |
| ·伴侣蛋白Prefoldin 1在RV感染细胞中的亚细胞分布变化 | 第122-124页 |
| ·动力蛋白轻链DLC8在感染N2a细胞中的分布 | 第124页 |
| ·宿主基因在RV感染细胞中的转录水平变化 | 第124页 |
| ·TRiC/CCT和DLC8在pCI-N转染细胞中的亚细胞分布 | 第124-126页 |
| ·TRiC/CCT和DLC8在pCI-P转染细胞中的亚细胞分布 | 第126-127页 |
| ·N、P二质粒共转染对于NB样结构形成的必要性 | 第127页 |
| ·TRiC/CCT在真核表达质粒共转染细胞中的亚细胞定位 | 第127-128页 |
| ·DLC8和PFDN1在双质粒共转细胞中与内氏小体结构的共定位 | 第128-129页 |
| ·宿主基因在质粒转染细胞中的转录水平变化 | 第129页 |
| ·RNA干扰细胞系的建立 | 第129-130页 |
| ·慢病毒介导的CCT_γ和CCTα干扰导致培养上清中病毒滴度的显著下降 | 第130-132页 |
| ·细胞内病毒基因组拷贝数的降低 | 第132页 |
| ·CCTγ和CCTα对病毒各结构蛋白转录和翻译的影响 | 第132-134页 |
| 3. 讨论 | 第134-137页 |
| 总结与展望 | 第137-139页 |
| 参考文献 | 第139-154页 |
| 附录 | 第154-163页 |
| 附录A 缩写词索引 | 第154-156页 |
| 附录B 常用缓冲液及培养基配方 | 第156-162页 |
| 附录C 攻博期间发表或待发表的学术论文 | 第162-163页 |
| 致谢 | 第163页 |
