| 摘要 | 第1-6页 |
| Abstract | 第6-13页 |
| 第一部分 文献综述 | 第13-26页 |
| ·BP-DNASE Ⅰ的研究概况 | 第13-17页 |
| ·Bp-DNase Ⅰ的发现和结构 | 第13页 |
| ·Bp-DNase Ⅰ的性质 | 第13-14页 |
| ·Bp-DNase Ⅰ基因的结构特点 | 第14页 |
| ·Bp-DNase Ⅰ的酶学性质 | 第14-15页 |
| ·Bp-DNase Ⅰ的应用 | 第15-16页 |
| ·Bp-DNase Ⅰ的制备 | 第16-17页 |
| ·直接提取法 | 第16页 |
| ·原核表达法 | 第16-17页 |
| ·真核表达法 | 第17页 |
| ·基因合成 | 第17-18页 |
| ·全基因合成的目的和意义 | 第17-18页 |
| ·全基因合成的现状及各种方法的优缺点 | 第18页 |
| ·基因表达的研究概况 | 第18-20页 |
| ·酵母表达系统 | 第20-24页 |
| ·P.Pastoris表达系统的特点 | 第20-21页 |
| ·P.Pastoris表达宿主菌株 | 第21-22页 |
| ·P.Pastoris表达载体 | 第22页 |
| ·整合方式及转化方法 | 第22-23页 |
| ·整合方式 | 第22-23页 |
| ·转化方式 | 第23页 |
| ·影响外源蛋白在P.Pastoris中高效表达的因素 | 第23-24页 |
| ·外源基因的特性 | 第23页 |
| ·宿主菌的影响 | 第23-24页 |
| ·表达载体的影响 | 第24页 |
| ·培养条件的影响 | 第24页 |
| ·本文的研究意义与目的 | 第24-26页 |
| 第二部分 材料与方法 | 第26-42页 |
| ·材料 | 第26-31页 |
| ·菌株和质粒 | 第26-27页 |
| ·菌株 | 第26页 |
| ·质粒表 | 第26-27页 |
| ·培养基 | 第27页 |
| ·试剂和酶 | 第27页 |
| ·试剂 | 第27页 |
| ·酶 | 第27页 |
| ·试剂盒 | 第27页 |
| ·仪器和设备 | 第27-28页 |
| ·实验主要涉及的溶液 | 第28-29页 |
| ·质粒提取所用的溶液 | 第28页 |
| ·SDS-PAGE溶液 | 第28-29页 |
| ·其他溶液 | 第29页 |
| ·有关DNASE Ⅰ的引物 | 第29-31页 |
| ·方法 | 第31-42页 |
| ·Bp-DNase Ⅰ基因的全合成 | 第31-32页 |
| ·合成基因所用引物的设计 | 第31页 |
| ·PCR扩增Bp-DNase Ⅰ基因 | 第31-32页 |
| ·回收目的DNA片段 | 第32-34页 |
| ·Muts处理目的DNA的方法 | 第33页 |
| ·Muts处理目的DNA后检测方法 | 第33-34页 |
| ·DH10β感受态细胞的制备 | 第34页 |
| ·大肠杆菌的转化 | 第34-35页 |
| ·快速转化 | 第34-35页 |
| ·常规转化 | 第35页 |
| ·P.Pastoris GS115电转感受态细胞的制备 | 第35页 |
| ·质粒DNA的抽提 | 第35-36页 |
| ·P.Pastoris重组表达载体的构建 | 第36页 |
| ·P.Pastoris的电击转化 | 第36-37页 |
| ·重组毕氏酵母的鉴定 | 第37页 |
| ·外源基因在毕赤酵母中的诱导表达 | 第37页 |
| ·SDS-PAGE检测目的蛋白表达 | 第37-38页 |
| ·目的蛋白的质谱验证 | 第38-39页 |
| ·目的蛋白浓度测定 | 第39-40页 |
| ·Bp-DNase Ⅰ酶学性质分析 | 第40-42页 |
| ·酶活测定方法 | 第40页 |
| ·pH对Bp-DNase Ⅰ活性的影响 | 第40-41页 |
| ·温度对Bp-DNase Ⅰ活性的影响 | 第41页 |
| ·N-糖基化分析 | 第41-42页 |
| 第三部分 结果与分析 | 第42-53页 |
| ·Bp-DNASE Ⅰ的克隆、表达及酶学性质 | 第42-53页 |
| ·Bp-DNASE Ⅰ密码子优化前后DNAMAN软件比对结果 | 第42-43页 |
| ·Bp-DNASE Ⅰ的基因合成 | 第43-44页 |
| ·Bp-DNASE Ⅰ毕赤酵母表达载体的构建 | 第44-46页 |
| ·pHBM-DN的毕赤酵母转化及转化子的鉴定 | 第46-47页 |
| ·Bp-DNase Ⅰ在毕赤酵母中的表达 | 第47-48页 |
| ·Bp-DNase Ⅰ酶学性质的分析 | 第48-51页 |
| ·pH对Bp-DNase Ⅰ的活性的影响 | 第48-50页 |
| ·温度对Bp-DNase Ⅰ的活性的影响 | 第50-51页 |
| ·Bp-DNase Ⅰ的糖基化分析 | 第51-53页 |
| 第四部分 讨论与展望 | 第53-56页 |
| ·本研究制备BP-DNASE Ⅰ方法的优点 | 第53-54页 |
| ·Bp-DNase Ⅰ酶学性质的优越性 | 第53-54页 |
| ·本研究制备Bp-DNase Ⅰ技术路线的优越性 | 第54页 |
| ·N-糖基化修饰对BP-DNASE Ⅰ酶学性质的影响 | 第54页 |
| ·展望 | 第54-56页 |
| ·Bp-DNase Ⅰ毕赤酵母转化子高表达量的筛选 | 第54页 |
| ·O-糖基化修饰对Bp-DNase Ⅰ酶学性质的影响 | 第54-55页 |
| ·三种突变体在毕赤酵母中的表达及其酶学性质的研究 | 第55-56页 |
| 参考文献 | 第56-62页 |
| 致谢 | 第62页 |
