| 摘要 | 第1-10页 |
| Abstract | 第10-14页 |
| 1 引言 | 第14-38页 |
| ·RNA介导的病毒抗性 | 第15-21页 |
| ·病毒是怎样应对沉默的? | 第15-17页 |
| ·转录后基因沉默广泛存在吗? | 第17-19页 |
| ·生物技术应用基因沉默是危险的吗? | 第19-20页 |
| ·问题 | 第20页 |
| ·结论 | 第20-21页 |
| ·植物中RNA 沉默的病毒抑制 | 第21-31页 |
| ·病毒编码的沉默抑制子的发现和多样性 | 第21-22页 |
| ·沉默抑制子的鉴定程序和基本特征 | 第22-23页 |
| ·基于病毒的异源表达和症状加重 | 第22-23页 |
| ·整株植物中转基因诱导基因沉默的转换 | 第23页 |
| ·农杆菌介导的瞬时表达分析 | 第23页 |
| ·异源互补和RNA 介导的交叉保护的限制 | 第23页 |
| ·病毒生物和沉默抑制的关系 | 第23-26页 |
| ·一些沉默抑制子的特征和可能的作用模型 | 第26-28页 |
| ·作为RNA 沉默途径中分子探针的病毒抑制子 | 第28-29页 |
| ·沉默和病毒症状的抑制 | 第29页 |
| ·沉默抑制子的生物技术应用 | 第29-30页 |
| ·扩增子系统 | 第29-30页 |
| ·农杆菌介导的高效瞬时表达系统 | 第30页 |
| ·结论 | 第30-31页 |
| ·植物病毒运动蛋白与转录后基因沉默 | 第31-36页 |
| ·植物病毒运动蛋白的类型及作用机制 | 第31-34页 |
| ·植物病毒运动蛋白介导的抗病性 | 第34页 |
| ·植物病毒运动蛋白与转录后基因沉默 | 第34-36页 |
| ·本研究的立题依据和主要研究内容 | 第36-38页 |
| 2 材料与方法 | 第38-54页 |
| ·材料 | 第38页 |
| ·毒源 | 第38页 |
| ·菌株、质粒 | 第38页 |
| ·酶 | 第38页 |
| ·缓冲液及培养基 | 第38页 |
| ·化学试剂、分子生物学试剂 | 第38页 |
| ·方法 | 第38-54页 |
| ·病毒的提纯及病毒RNA 的提取 | 第38-39页 |
| ·病毒的提纯 | 第38-39页 |
| ·病毒RNA 的提取 | 第39页 |
| ·cDNA 的合成及PCR 扩增 | 第39-41页 |
| ·合成引物 | 第39-40页 |
| ·反转录 | 第40页 |
| ·PCR 扩增 | 第40-41页 |
| ·PCR 产物的纯化 | 第41页 |
| ·PVX 25KD 运动蛋白基因与外壳蛋白基因的克隆 | 第41-43页 |
| ·感受态细胞的制备 | 第41-42页 |
| ·质粒DNA 和扩增的目的片段的酶切 | 第42页 |
| ·质粒DNA 与目的片段DNA 的连接 | 第42页 |
| ·质粒DNA 向大肠杆菌中转化(热激法) | 第42-43页 |
| ·转化菌落PCR 鉴定 | 第43页 |
| ·质粒提取 | 第43页 |
| ·重组质粒的酶切鉴定及PCR 鉴定 | 第43页 |
| ·基因序列的测定 | 第43页 |
| ·植物表达载体的构建 | 第43-45页 |
| ·植物表达载体的构建策略 | 第43-44页 |
| ·目的片段与植物表达载体的连接 | 第44页 |
| ·重组质粒向大肠杆菌的转化 | 第44页 |
| ·重组质粒向农杆菌转化(冻融法) | 第44-45页 |
| ·目的基因向烟草中的转化及植株再生 | 第45页 |
| ·转基因植株的抗病性及ELISA 检测 | 第45页 |
| ·植物总DNA 的提取(CTAB 法)及PCR 检测 | 第45-47页 |
| ·植物总DNA 的提取(CTAB 法) | 第46页 |
| ·转基因植株的PCR 检测 | 第46-47页 |
| ·转基因植株的抗病性鉴定及ELISA 检测 | 第47页 |
| ·转基因植株的抗病性鉴定 | 第47页 |
| ·ELISA 检测 | 第47页 |
| ·转基因植株的Southern blot 分析 | 第47-50页 |
| ·植物总DNA 的酶切 | 第47页 |
| ·DNA 凝胶电泳 | 第47-48页 |
| ·转膜 | 第48页 |
| ·探针的制备 | 第48-50页 |
| ·DNA 片段的获得 | 第48-50页 |
| ·准备模板 | 第50页 |
| ·合成反应 | 第50页 |
| ·杂交 | 第50页 |
| ·转基因植株总RNA 的提取及Northern blot 分析 | 第50-54页 |
| ·植物总RNA 的提取(异硫氢酸胍法) | 第50-51页 |
| ·在含有甲醛的凝胶上进行RNA 电泳 | 第51-52页 |
| ·转膜 | 第52-53页 |
| ·探针制备 | 第53页 |
| ·杂交 | 第53-54页 |
| 3 结果与分析 | 第54-75页 |
| ·病毒RNA 的提取 | 第54页 |
| ·RT-PCR 扩增PVX 25KD运动蛋白基因和外壳蛋白基因 | 第54-55页 |
| ·外源DNA与质粒载体的连接及重组质粒向大肠杆菌中的转化 | 第55-56页 |
| ·重组质粒的酶切鉴定 | 第56-57页 |
| ·cDNA 的序列测定 | 第57-59页 |
| ·植物表达载体的构建 | 第59-63页 |
| ·植物表达载体的构建策略 | 第59-62页 |
| ·目的片段与植物表达载体的连接 | 第62-63页 |
| ·转化菌落PCR 检测 | 第62页 |
| ·转化菌落酶切检测 | 第62-63页 |
| ·重组质粒向农杆菌中转化 | 第63页 |
| ·烟草遗传转化及T0 代转基因植株再生 | 第63-66页 |
| ·转基因植株的抗病性分析 | 第66-75页 |
| ·转基因植株的抗病表现型及ELISA 检测 | 第66-69页 |
| ·转基因植株的PCR 检测 | 第69-70页 |
| ·转基因植株的Southern blot 分析 | 第70-72页 |
| ·转基因(非转基因)植株DNA 的酶切 | 第70-71页 |
| ·转基因植株的 Southern blot 分析 | 第71-72页 |
| ·转基因植株的 Northern blot 分析 | 第72-75页 |
| 4 讨论 | 第75-77页 |
| ·马铃薯 X 病毒与 RNA 介导的病毒抗性 | 第75页 |
| ·关于植物病毒运动蛋白介导的抗病性 | 第75页 |
| ·关于转非翻译PVX-CP与 PVX-p25基因植株的抗病性分析 | 第75-76页 |
| ·关于转基因拷贝数与抗病性间的关系 | 第76-77页 |
| 5 结论 | 第77-78页 |
| 参考文献 | 第78-92页 |
| 附录 | 第92-102页 |
| 致谢 | 第102-103页 |
| 发表论文 | 第103页 |
