| 中文摘要 | 第1-11页 |
| 英文摘要 | 第11-17页 |
| 缩写词简表 | 第17-22页 |
| 前言 | 第22-26页 |
| 技术路线图 | 第26-28页 |
| 第一章 人胚胎干细胞和拟胚体基因表达谱的初步分析 | 第28-50页 |
| 第一节 材料和方法 | 第28-37页 |
| 1.材料与试剂 | 第28-30页 |
| ·细胞 | 第28页 |
| ·实验动物 | 第28页 |
| ·主要实验仪器 | 第28-29页 |
| ·试剂 | 第29页 |
| ·引物是由引物设计软件Primer 5.0设计,大连TaKaRa公司与上海英骏公司合成。 | 第29-30页 |
| 2.方法 | 第30-37页 |
| ·饲养层的制备 | 第30页 |
| ·人ES细胞的培养、冻存及EBs制备 | 第30-31页 |
| ·基因芯片检测 | 第31-35页 |
| ·两步法RT-PCR | 第35-36页 |
| ·Real-time PCR | 第36页 |
| ·基因分类(Gene ontology,GO)分析 | 第36-37页 |
| 第二节 结果 | 第37-46页 |
| 1.人ES细胞培养及EBs形成 | 第37页 |
| 2.比较未分化的人ES细胞与分化7天的EBs(7-day EBs)的基因表达谱 | 第37-39页 |
| ·准备RNA | 第37-38页 |
| ·基因芯片检测结果 | 第38-39页 |
| 3.验证基因芯片结果 | 第39-40页 |
| 4.GO分析结果 | 第40-46页 |
| 第三节 分析与讨论 | 第46-50页 |
| 第二章 人胚胎干细胞特异性高表达新基因的克隆 | 第50-72页 |
| 第一节 材料与方法 | 第50-55页 |
| 1.材料与试剂 | 第50-51页 |
| ·细胞 | 第50页 |
| ·主要实验仪器 | 第50页 |
| ·试剂 | 第50页 |
| ·引物是由引物设计软件Primer 5.0设计,大连TaKaRa公司与上海英骏公司合成。 | 第50-51页 |
| 2.方法 | 第51-55页 |
| ·组织和细胞总RNA的提取 | 第51页 |
| ·快速扩增cDNA序列5'末端(Rapid amplification of cDNA ends,5'-RACE) | 第51页 |
| ·PCR产物纯化测序 | 第51页 |
| ·Northern Blot | 第51-53页 |
| ·两步法RT-PCR | 第53-54页 |
| ·畸胎瘤及EBs形成实验 | 第54页 |
| ·维甲酸(Retinoic acid,RA)诱导分化实验 | 第54-55页 |
| 第二节 结果 | 第55-66页 |
| 1.新基因克隆 | 第55-57页 |
| ·EST序列拼接 | 第55页 |
| ·5'-RACE | 第55-57页 |
| 2.转录本大小 | 第57页 |
| 3.生物信息学分析 | 第57-64页 |
| ·基因序列分析 | 第57-58页 |
| ·蛋白序列分析 | 第58-61页 |
| ·转录起始位点分析 | 第61-62页 |
| ·启动子及转录因子结合位点分析 | 第62-64页 |
| 4.HESRG基因表达分布 | 第64页 |
| 5.HESRG与人ES细胞分化及多潜能性的关系 | 第64-66页 |
| 第三节 分析与讨论 | 第66-72页 |
| 第三章 HESRG基因的功能及转录调控研究 | 第72-105页 |
| 第一节 材料和方法 | 第72-80页 |
| 1.材料与试剂 | 第72-74页 |
| ·细胞 | 第72页 |
| ·主要实验仪器 | 第72页 |
| ·主要试剂 | 第72-73页 |
| ·所用引物 | 第73-74页 |
| ·抗体 | 第74页 |
| 2.方法 | 第74-80页 |
| ·siRNA制备 | 第74页 |
| ·siRNA转染人ES细胞 | 第74-75页 |
| ·细胞表面标志物的检测 | 第75页 |
| ·细胞基因组DNA的抽提 | 第75页 |
| ·质粒重组、转化、抽提与鉴定 | 第75-77页 |
| ·细胞转染及荧光素酶报告基因活性分析 | 第77-78页 |
| ·染色质免疫沉淀实验(ChIP) | 第78-79页 |
| ·统计学分析 | 第79-80页 |
| 第二节 结果 | 第80-97页 |
| 1.在人ES细胞中建立高效的siRNA干扰方法 | 第80-84页 |
| ·建立稳定表达eGFP报告基因的人ES细胞系 | 第80页 |
| ·特异性抑制人ES细胞中外源性基因eGFP的表达 | 第80-81页 |
| ·特异性抑制人ES细胞中内源性基因Oct4的表达 | 第81-84页 |
| 2.HESRG基因功能研究 | 第84-88页 |
| ·利用siRNA特异性抑制人ES细胞中HESRG基因表达 | 第84-85页 |
| ·检测HESRG表达下调后人ES细胞的分化状态 | 第85-88页 |
| 3.HESRG启动子区活性分析 | 第88-90页 |
| ·PCR扩增HESRG基因调控序列并构建荧光素酶报告载体pGL3-2049/+11 | 第88-90页 |
| ·检测HESRG基因转录起始位点上游序列-2049/+11启动子活性 | 第90页 |
| 4.HESRG启动子区域中Oct4结合序列的增强子活性分析 | 第90-92页 |
| ·构建Oct4结合序列突变的突变体报告载体 | 第90-91页 |
| ·荧光素酶活性分析 | 第91-92页 |
| 5.抑制内源性Oct4表达对HESRG基因启动子区域的调控作用 | 第92-93页 |
| 6.Oct4对HESRG基因启动子区域的调控作用 | 第93-95页 |
| ·构建Oct4基因的真核表达载体 | 第93-94页 |
| ·荧光素酶活性分析 | 第94-95页 |
| 7.ChIP实验确定HESRG基因启动子区Oct4结合位点 | 第95-97页 |
| 第三节 分析与讨论 | 第97-105页 |
| 1 RNA干扰技术 | 第97-99页 |
| 2 HESRG基因的功能 | 第99-101页 |
| 3 HESRG的转录调控 | 第101-105页 |
| 结论 | 第105-106页 |
| 参考文献 | 第106-115页 |
| 综述 | 第115-130页 |
| 参考文献 | 第123-130页 |
| 致谢 | 第130-132页 |
| 攻读学位期间主要研究成果 | 第132-133页 |
| 简历 | 第133页 |
