| 摘要 | 第4-5页 |
| Abstract | 第5页 |
| 1. 前言 | 第12-44页 |
| 1.1 手足口病的概述 | 第12-14页 |
| 1.1.1 手足口病的简介 | 第12-13页 |
| 1.1.2 手足口病的流行病学 | 第13-14页 |
| 1.1.3 手足口病的预防与治疗 | 第14页 |
| 1.2 肠道病毒71型(EV71) | 第14-18页 |
| 1.2.1 EV71病毒颗粒 | 第15-16页 |
| 1.2.2 EV71生活史与致病机制 | 第16-18页 |
| 1.2.3 EV71的临床诊断 | 第18页 |
| 1.3 EV713C蛋白酶 | 第18-25页 |
| 1.3.1 小RNA病毒3C蛋白酶简介 | 第18-19页 |
| 1.3.2 EV71 3C蛋白酶的结构 | 第19-21页 |
| 1.3.3 EV71 3C蛋白酶的作用 | 第21-23页 |
| 1.3.4 EV71 3C蛋白酶抑制剂 | 第23-25页 |
| 1.4 EV712A蛋白酶 | 第25-31页 |
| 1.4.1 EV71 2A蛋白酶的简介 | 第25-27页 |
| 1.4.2 同源HRV2 2A蛋白酶的结构研究 | 第27-29页 |
| 1.4.3 EV71 2A蛋白酶结构研究 | 第29-30页 |
| 1.4.4 EV71 2A蛋白酶抑制剂 | 第30-31页 |
| 1.5 基于片段的药物发现 | 第31-38页 |
| 1.5.1 基于片段的药物发现简介 | 第31-32页 |
| 1.5.2 基于片段的药物发现流程 | 第32-34页 |
| 1.5.3 基于片段筛的药物筛选方法 | 第34-38页 |
| 1.5.3.1 X射线单晶衍射在片段筛选中的应用 | 第34-35页 |
| 1.5.3.2 核磁共振技术在片段筛选中的应用 | 第35-38页 |
| 1.6 蛋白质晶体学 | 第38-41页 |
| 1.6.1 蛋白质晶体学概述 | 第38-39页 |
| 1.6.2 蛋白质结晶 | 第39-41页 |
| 1.6.2.1 蛋白结晶的原理及方法 | 第39-40页 |
| 1.6.2.2 影响蛋白结晶的因素 | 第40-41页 |
| 1.6.3 数据处理和结构修正 | 第41页 |
| 1.7 分子对接 | 第41-42页 |
| 1.7.1 分子对接的概述 | 第41-42页 |
| 1.8 研究意义与目的 | 第42-44页 |
| 2. 材料与方法 | 第44-63页 |
| 2.1 实验材料 | 第44-46页 |
| 2.1.1 质粒与菌株 | 第44页 |
| 2.1.2 主要试剂 | 第44-45页 |
| 2.1.3 主要仪器 | 第45-46页 |
| 2.2 常用试剂的配置 | 第46-51页 |
| 2.2.1 分子克隆相关试剂 | 第46页 |
| 2.2.2 质粒转化和蛋白表达相关试剂 | 第46-47页 |
| 2.2.3 电泳相关试剂 | 第47-48页 |
| 2.2.4 重组蛋白纯化相关试剂 | 第48-51页 |
| 2.3 实验方法 | 第51-63页 |
| 2.3.1 载体质粒的准备 | 第51-52页 |
| 2.3.1.1 感受态细胞的制备 | 第51页 |
| 2.3.1.2 质粒转化 | 第51-52页 |
| 2.3.1.3 质粒提取 | 第52页 |
| 2.3.2 重组质粒的构建 | 第52-55页 |
| 2.3.2.1 引物设计 | 第52页 |
| 2.3.2.2 目的片段的PCR | 第52-54页 |
| 2.3.2.3 双酶切载体 | 第54页 |
| 2.3.2.4 LIC法构建重组质粒 | 第54-55页 |
| 2.3.2.5 定点突变 | 第55页 |
| 2.3.3 重组蛋白的表达 | 第55-57页 |
| 2.3.3.1 重组蛋白的试表达 | 第55-56页 |
| 2.3.3.2 重组蛋白的大量表达 | 第56页 |
| 2.3.3.3 SDS-PAGE检测 | 第56-57页 |
| 2.3.4 重组蛋白的纯化 | 第57-60页 |
| 2.3.4.1 EV71 3C蛋白酶的纯化 | 第57-59页 |
| 2.3.4.2 活性EV71 2A蛋白酶的纯化 | 第59页 |
| 2.3.4.3 HRV2 2A蛋白酶的纯化 | 第59-60页 |
| 2.3.5 重组蛋白的结晶 | 第60-61页 |
| 2.3.5.1 EV71 3C蛋白酶的结晶及浸泡 | 第60页 |
| 2.3.5.2 EV71 2A蛋白酶的初筛 | 第60-61页 |
| 2.3.6 晶体结构的解析 | 第61页 |
| 2.3.7 NMR验证相互作用 | 第61-62页 |
| 2.3.8 抑制剂对蛋白酶IC_(50)的测定 | 第62-63页 |
| 2.3.8.1 荧光底物多肽的设计 | 第62页 |
| 2.3.8.2 抑制剂对EV71 2A蛋白酶的IC_(50)值测定 | 第62-63页 |
| 3. 结果与讨论 | 第63-87页 |
| 3.1 EV713C蛋白酶的片段筛选 | 第63-79页 |
| 3.1.1 EV71 3C蛋白酶的表达纯化 | 第63-65页 |
| 3.1.2 EV71 3C蛋白酶的结晶 | 第65-67页 |
| 3.1.3 EV71 3C蛋白酶与片段复合物晶体 | 第67页 |
| 3.1.4 数据收集和结构解析 | 第67-70页 |
| 3.1.5 复合物结构及NMR验证 | 第70-74页 |
| 3.1.6 片段设计及分子对接 | 第74-78页 |
| 3.1.7 讨论 | 第78-79页 |
| 3.2 活性EV71 2A蛋白酶的结晶初筛 | 第79-82页 |
| 3.2.1 活性EV71 2A蛋白酶的表达纯化 | 第79-81页 |
| 3.2.2 活性EV71 2A蛋白酶的结晶条件筛选 | 第81-82页 |
| 3.3 HRV2 2A蛋白酶的纯化 | 第82-87页 |
| 3.3.1 HRV2 2A蛋白酶的试表达 | 第82-83页 |
| 3.3.2 HRV2 2A蛋白酶的纯化 | 第83-85页 |
| 3.3.3 讨论 | 第85-87页 |
| 4. 总结与展望 | 第87-89页 |
| 参考文献 | 第89-95页 |
| 致谢 | 第95页 |