摘要 | 第4-6页 |
Abstract | 第6-8页 |
第一章 天然产物衍生物P-13抑制STAT3信号通路的机理研究 | 第13-60页 |
第1节 引言 | 第13-23页 |
1.1 JAK/STAT信号通路 | 第13-17页 |
1.1.1 JAK/STAT信号通路组成 | 第13-14页 |
1.1.2 JAK/STAT信号通路转导 | 第14-16页 |
1.1.3 JAK/STAT信号通路调控 | 第16-17页 |
1.2 JAK/STAT信号通路与肿瘤 | 第17-18页 |
1.3 JAK/STAT信号通路的抑制剂 | 第18-21页 |
1.3.1 因子或者受体拮抗剂 | 第19页 |
1.3.2 JAK蛋白抑制剂 | 第19-21页 |
1.3.3 STAT蛋白抑制剂 | 第21页 |
1.4 天然化合物与抗肿瘤 | 第21-23页 |
第2节 实验材料与方法 | 第23-33页 |
2.1 实验材料 | 第23-26页 |
2.1.1 化合物及药品 | 第23页 |
2.1.2 试剂 | 第23-24页 |
2.1.3 抗体 | 第24-25页 |
2.1.4 细胞系和培养条件 | 第25页 |
2.1.5 常用溶液配制 | 第25-26页 |
2.2 实验方法 | 第26-33页 |
2.2.1 MTT噻唑蓝比色法 | 第26页 |
2.2.2 质粒转染 | 第26-27页 |
2.2.3 细胞周期流式检测 | 第27页 |
2.2.4 荧光素酶活性检测(Luciferase activity) | 第27-28页 |
2.2.5 蛋白印迹(Western blot)分析 | 第28页 |
2.2.6 体外激酶活性检测 | 第28-29页 |
2.2.7 动物模型给药实验 | 第29页 |
2.2.8 化合物与谷胱甘肽的共价结合质谱检测 | 第29-30页 |
2.2.9 Cu(D-催化[3+2]叠氮-炔烃环加成(CuAAC)和Pull-down蛋白分析 | 第30-31页 |
2.2.10 观察肌动蛋白Actin的免疫荧光实验 | 第31页 |
2.2.11 蛋白质谱鉴定化合物结合位点 | 第31-32页 |
2.2.12 分子对接实验 | 第32页 |
2.2.13 细胞活性氧(Reactive oxygen species,ROS)含量检测 | 第32页 |
2.2.14 结晶紫实验(Crystal Violet Staining Solution) | 第32页 |
2.2.15 P-13与IKK-β蛋白对接 | 第32-33页 |
第3节 实验结果 | 第33-57页 |
3.1 天明精中量丰天然产物的活性筛选及结构优化 | 第33-34页 |
3.2 P-13是泛JAK激酶抑制剂 | 第34-39页 |
3.2.1 P-13抑制IL-6/STAT3调控的荧光素酶的表达 | 第34-35页 |
3.2.2 P-13抑制IL-6诱导的和组成型活化的STAT3蛋白酪氨酸705位点的磷酸化 | 第35-37页 |
3.2.3 P-13抑制IL-6诱导的JAK2蛋白Y1007/1008的磷酸化 | 第37页 |
3.2.4 P-13抑制体外全长JAK2蛋白的激酶活性 | 第37-38页 |
3.2.5 P-13抑制其它JAK家族蛋白的激活 | 第38-39页 |
3.3 P-13共价抑制JAK2 | 第39-46页 |
3.3.1 GSH或者DTT可以逆转P-13对IL-6/STAT3信号通路的抑制作用 | 第39-40页 |
3.3.2 P-13共价结合GSH | 第40页 |
3.3.3 α,β不饱和羰基是P-13的关键活性结构 | 第40-41页 |
3.3.4 P-13不可逆地抑制IL-6/STAT3信号转导 | 第41-42页 |
3.3.5 P-13垂钓JAK2蛋白 | 第42-44页 |
3.3.6 P-13优先结合JAK2蛋白SH2结构域的Cysteine 452位点 | 第44-45页 |
3.3.7 P-13不抑制JAK2蛋白JH1激酶域的活性 | 第45-46页 |
3.4 P-13对STAT3信号通路的抑制具有一定选择性 | 第46-52页 |
3.4.1 P-13选择性地结合JAK家族蛋白 | 第46-48页 |
3.4.2 P-13不抑制RTK和ser/thr家族蛋白信号转导 | 第48-50页 |
3.4.3 P-13不破坏Actin的结构 | 第50-51页 |
3.4.4 P-13对细胞中ROS(Reactive oxygen species,ROS)和GSH的水平影响很小 | 第51-52页 |
3.5 P-13的体外体内抗肿瘤活性 | 第52-55页 |
3.5.1 P-13优先抑制具有本底组成型活化的STAT3的癌细胞生长并且诱导细胞凋亡 | 第52-54页 |
3.5.2 P-13抑制体内肿瘤生长 | 第54-55页 |
3.6 P-13与经典抗肿瘤药物联合应用具有协同作用 | 第55-57页 |
第4节 小结与讨论 | 第57-60页 |
第二章 共价键化合物在中药治疗疾病中的功能和机理研究 | 第60-112页 |
第1节 引言 | 第60-71页 |
1.1 中草药 | 第60-62页 |
1.2.1 中草药中的活性分子 | 第61页 |
1.2.2 中草药中活性分子的结构特征 | 第61-62页 |
1.2 共价键化合物的特性 | 第62-64页 |
1.2.1 共价键化合物的反应过程 | 第62-63页 |
1.2.2 共价键化合物药物效应动力学(pharmacodynamics,PD)和药物代谢动力学(pharmacokinetics,PK)的关系 | 第63-64页 |
1.3 共价键化合物与蛋白间的相互作用时间 | 第64-66页 |
1.3.1 蛋白turnover | 第64-65页 |
1.3.2 Compound pulse-chase法检测相互作用时间 | 第65-66页 |
1.4 刀豆蛋白A(Concanavalin A,Con A)引起的急性肝损伤模型 | 第66-70页 |
1.4.1 ConA诱导急性肝损伤 | 第66-67页 |
1.4.2 参与ConA诱导的肝损伤中的关键细胞和炎症因子 | 第67-70页 |
1.5 本章要探究的问题 | 第70-71页 |
第2节 实验材料与方法 | 第71-77页 |
2.1 实验材料 | 第71页 |
2.1.1 试剂和抗体 | 第71页 |
2.1.2 细胞株及培养 | 第71页 |
2.2 实验方法 | 第71-77页 |
2.2.1 ConA诱导的急性肝损伤模型建立 | 第71-72页 |
2.2.2 动物组织免疫荧光实验 | 第72-73页 |
2.2.3 生化检测ALT/AST | 第73页 |
2.2.4 Compound pulse-chase实验 | 第73页 |
2.2.5 动物组织标本HE (hematoxylin-eosin staining)染色 | 第73-75页 |
2.2.6 THP-1巨噬细胞诱导分化和刺激 | 第75页 |
2.2.7 RT-PCR | 第75-77页 |
第3节 实验结果 | 第77-107页 |
3.1 共价键化合物广泛存在于植物和中草药 | 第77-80页 |
3.1.1 共价键化合物广泛存在于植物 | 第77-78页 |
3.1.2 共价键化合物广泛存在于中草药 | 第78-80页 |
3.2 P-alk与体外蛋白的相互作用 | 第80-84页 |
3.2.1 P-alk和不同靶点间的相互作用时间不同 | 第80-82页 |
3.2.2 蛋白酶体抑制剂bortezomib延长P-alk和靶点的相互作用时间 | 第82-84页 |
3.2.3 Bortezomib延长P-alk对IL-6/STAT3信号通路的抑制作用 | 第84页 |
3.3 共价键化合物具有累积效应 | 第84-87页 |
3.3.1 共价键化合物具有体积效应 | 第84-85页 |
3.3.2 P-alk具有重复给药的累积效应 | 第85-87页 |
3.4 P-alk在小鼠体内的分布情况 | 第87-90页 |
3.4.1 P-alk在Balb/c和C57BL/6J小鼠中组织的分布pattern相似 | 第87-88页 |
3.4.2 灌胃和尾静脉两种给药方式造成P-alk在组织中分布pattern不同 | 第88页 |
3.4.3 P-alk灌胃后富集在肝脏部位 | 第88-89页 |
3.4.4 P-alk尾静脉注射后均匀分布到各组织 | 第89-90页 |
3.5 P-alk逆转ConA诱导的急性肝损伤 | 第90-96页 |
3.5.1 P-alk体外抑制肝细胞中的IFN-γ/STAT1活化 | 第90-91页 |
3.5.2 P-alk结合肝脏蛋白,具有剂量依赖性 | 第91-92页 |
3.5.3 P-alk抑制肝脏中ConA诱导的JAK2/STAT1活化 | 第92-95页 |
3.5.4 P-alk逆转ConA诱导的肝损伤 | 第95-96页 |
3.6 P-alk和体内蛋白的相互作用 | 第96-100页 |
3.6.1 P-alk与不同组织蛋白的相互作用时间各不相同 | 第96-98页 |
3.6.2 P-alk和肝脏组织中JAKs蛋白相互作用时间 | 第98-100页 |
3.7 P-alk在肝脏JAK2蛋白上累积,具有剂量依赖性 | 第100-104页 |
3.7.1 250 mg/kg的P-alk重复给药在JAK2蛋白上累积 | 第100-103页 |
3.7.2 80 mg/kg的P-alk重复给药未能在JAK2蛋白上累积 | 第103-104页 |
3.8 含有α,β不饱和羰基的冬凌草甲素(Oridonin,Ori)治疗ConA诱导的肝损伤比非共价键的JAK2抑制剂Ruxolitinib (Ruxo)更有优势 | 第104-107页 |
第4节 小节与讨论 | 第107-112页 |
参考文献 | 第112-124页 |
附录 | 第124-125页 |
致谢 | 第125-128页 |
作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 | 第128页 |