| 致谢 | 第6-8页 |
| 摘要 | 第8-9页 |
| Abstract | 第9-10页 |
| 第一章 文献综述及研究背景 | 第14-23页 |
| 前言 | 第14页 |
| 1.1 真菌富含半胱氨酸类分泌蛋白 | 第14-15页 |
| 1.2 Cerato-platanin家族蛋白的研究进展 | 第15-16页 |
| 1.3 Cerato-platanins家族蛋白结构特点 | 第16-17页 |
| 1.4 Cerato-platanin家族蛋白的主要功能 | 第17-20页 |
| 1.4.1 Cerato-platanin家族蛋白在真菌生长发育中的作用 | 第17-18页 |
| 1.4.2 Cerato-platanin家族蛋白在植物-病菌互作中的作用 | 第18-20页 |
| 1.4.2.1 作为病原菌的毒力因子 | 第19页 |
| 1.4.2.2 激发寄主防卫反应 | 第19-20页 |
| 1.5 稻瘟菌中CP类蛋白MoSM1在菌和植物互作中的作用 | 第20-22页 |
| 1.6 本课题研究的目的意义及主要内容 | 第22-23页 |
| 1.6.1 研究目的及意义 | 第22页 |
| 1.6.2 研究的主要内容 | 第22-23页 |
| 第二章 酵母双杂交实验筛选水稻中与MoSM1互作的候选因子 | 第23-47页 |
| 2.1 材料与方法 | 第23-35页 |
| 2.1.1 植物材料 | 第23页 |
| 2.1.2 菌体、质粒和cDNA文库 | 第23页 |
| 2.1.3 主要生化试剂 | 第23页 |
| 2.1.4 常规分子克隆技术 | 第23-24页 |
| 2.1.4.1 普通PCR技术 | 第23-24页 |
| 2.1.4.2 高保真PCR反应扩增片段 | 第24页 |
| 2.1.4.3 菌液PCR反应 | 第24页 |
| 2.1.5 总RNA的提取和反转录合成cDNA | 第24-25页 |
| 2.1.5.1 采用Trizol法提取水稻叶片的总RNA | 第24页 |
| 2.1.5.2 合成cDNA | 第24-25页 |
| 2.1.6 PCR产物的纯化回收 | 第25-27页 |
| 2.1.6.1 连接反应 | 第25-27页 |
| 2.1.6.1.1 利用全式金的pEASY-Blunt-T载体进行连接反应 | 第25页 |
| 2.1.6.1.2 利用诺唯赞公司的Exnase同源重组酶进行in-fusion | 第25页 |
| 2.1.6.1.3 酶切反应 | 第25-26页 |
| 2.1.6.1.4 E.coli DH5α感受态细胞的制备 | 第26页 |
| 2.1.6.1.5 热激转化 | 第26页 |
| 2.1.6.1.6 质粒提取 | 第26-27页 |
| 2.1.7 农杆菌GV3101感受态制备及转化 | 第27页 |
| 2.1.7.1 农杆菌感受态制备 | 第27页 |
| 2.1.7.2 质粒转化农杆菌 | 第27页 |
| 2.1.8 酵母双杂交实验 | 第27-30页 |
| 2.1.8.1 酵母载体构建 | 第27-28页 |
| 2.1.8.2 Y2HGold酵母菌株活化 | 第28页 |
| 2.1.8.3 酵母感受态细胞的制备及转化 | 第28页 |
| 2.1.8.4 诱饵蛋白对酵母的生长毒性以及自激活活性检测 | 第28页 |
| 2.1.8.5 诱导蛋白与水稻酵母cDNA文库mating筛选互作蛋白 | 第28-29页 |
| 2.1.8.6 判断文库质量以及计算筛选到的细胞克隆总数 | 第29页 |
| 2.1.8.7 酵母质粒的提取 | 第29-30页 |
| 2.1.8.8 选择读码框正常的酵母质粒 | 第30页 |
| 2.1.8.9 酵母转化验证 | 第30页 |
| 2.1.9 进一步验证候选蛋白与MoSM1的互作 | 第30-34页 |
| 2.1.9.1 BiFC实验 | 第30-31页 |
| 2.1.9.1.1 构建YFP的N端和C端载体 | 第30-31页 |
| 2.1.9.1.2 观察荧光信号 | 第31页 |
| 2.1.9.2 荧光素互补成像实验(LCI) | 第31页 |
| 2.1.9.2.1 构建LUC的N端和C端载体 | 第31页 |
| 2.1.9.2.2 荧光素发光拍照 | 第31页 |
| 2.1.9.3 GST pull-down实验 | 第31-33页 |
| 2.1.9.3.1 His融合蛋白原核表达实验 | 第31-32页 |
| 2.1.9.3.2 His融合蛋白纯化实验 | 第32页 |
| 2.1.9.3.3 GST融合蛋白原核表达实验 | 第32-33页 |
| 2.1.9.3.4 GST融合蛋白纯化实验 | 第33页 |
| 2.1.9.3.5 体外蛋白结合分析 | 第33页 |
| 2.1.9.4 Co-IP实验 | 第33-34页 |
| 2.1.9.4.1 GFP标签融合质粒构建 | 第33-34页 |
| 2.1.9.4.2 HA标签融合载体构建 | 第34页 |
| 2.1.9.4.3 活体蛋白免疫沉淀实验 | 第34页 |
| 2.1.10 Western blot实验 | 第34-35页 |
| 2.2 结果与分析 | 第35-45页 |
| 2.2.1 诱饵蛋白在酵母细胞中的自激活以及细胞毒性检测 | 第35页 |
| 2.2.2 水稻cDNA文库中筛选与MoSM1互作的候选蛋白 | 第35-36页 |
| 2.2.3 酵母一对一筛选MoSM1互作蛋白 | 第36-39页 |
| 2.2.4 采用BiFC技术在烟草细胞中验证MoSM1互作蛋白 | 第39-41页 |
| 2.2.5 确定Y4和MoSM1的亚细胞定位 | 第41页 |
| 2.2.6 LCI系统检测MoSM1与Y4的互作情况 | 第41-43页 |
| 2.2.7 利用GST pull-down实验研究MoSM1与Y4的互作情况 | 第43-45页 |
| 2.2.7.1 原核诱导表达蛋白的获得 | 第43页 |
| 2.2.7.2 蛋白共孵育进行pull-down实验 | 第43-45页 |
| 2.3 讨论 | 第45-47页 |
| 第三章 利用IP-MS技术筛选MoSM1互作蛋白 | 第47-71页 |
| 3.1 材料和方法 | 第48-57页 |
| 3.1.1 主要生化试剂 | 第48页 |
| 3.1.2 实验方法 | 第48-56页 |
| 3.1.2.1 筛选阳性转基因植物技术 | 第48-54页 |
| 3.1.2.1.1 潮霉素筛选技术 | 第48-49页 |
| 3.1.2.1.2 PCR检测筛选阳性克隆苗 | 第49页 |
| 3.1.2.1.3 Western blot检测转基因植株中蛋白表达量 | 第49-50页 |
| 3.1.2.1.4 Southern blot检测转基因阳性水稻的基因拷贝数 | 第50-54页 |
| 3.1.2.2 利用转基因水稻进行的MoSM1互作蛋白筛选 | 第54-56页 |
| 3.1.2.2.1 蛋白免疫沉淀(IP)实验 | 第54-55页 |
| 3.1.2.2.2 免疫沉淀蛋白的质量检测 | 第55-56页 |
| 3.1.2.2.3 特异性条带进行质谱分析 | 第56页 |
| 3.1.3 亚细胞定位分析 | 第56-57页 |
| 3.1.3.1 利用转基因水稻观察亚细胞定位 | 第56页 |
| 3.1.3.1.1 利用转基因水稻的原生质体进行亚细胞定位观察 | 第56页 |
| 3.1.3.1.2 利用转基因水稻根尖细胞观察亚细胞定位 | 第56页 |
| 3.1.3.2 在烟草中瞬时表达观察亚细胞定位 | 第56-57页 |
| 3.2 结果与分析 | 第57-69页 |
| 3.2.1 转基因阳性苗的初步筛选鉴定 | 第57-58页 |
| 3.2.2 转基因单拷贝纯合体的筛选获得 | 第58-61页 |
| 3.2.2.1 探针制作及基因组DNA酶切 | 第58-60页 |
| 3.2.2.2 基因拷贝数检测 | 第60-61页 |
| 3.2.3 利用IP-MS实验筛选得到候选MoSM1互作蛋白 | 第61-65页 |
| 3.2.4 候选蛋白的筛选验证 | 第65-69页 |
| 3.2.4.1 酵母双杂交系统筛选质谱结果的候选基因 | 第65-66页 |
| 3.2.4.1.1 构建酵母双杂交载体,进行酵母双杂交一对一验证 | 第65-66页 |
| 3.2.4.2 荧光双分子互补实验筛选鉴定MoSM1互作因子 | 第66-69页 |
| 3.3 讨论 | 第69-71页 |
| 参考文献 | 第71-79页 |
| 本文引物序列 | 第79-84页 |
