| 摘要 | 第6-7页 |
| Abstract | 第7-8页 |
| 缩略语表 | 第9-10页 |
| 符号说明 | 第10-11页 |
| 1.研究背景 | 第11-22页 |
| 1.1 问题由来 | 第11页 |
| 1.2 文献综述 | 第11-22页 |
| 1.2.1 DNA甲基化 | 第11-18页 |
| 1.2.1.1 DNA甲基化的形成及生物学意义 | 第11-12页 |
| 1.2.1.2 DNA甲基化在神经系统中的作用 | 第12-13页 |
| 1.2.1.3 DNA甲基化的检测方法及测序方法 | 第13-16页 |
| 1.2.1.4 基于亚硫酸盐转换法的DNA甲基化测序生物信息学分析原理 | 第16-18页 |
| 1.2.2 神经元分离方法 | 第18-19页 |
| 1.2.3 海马-内嗅皮层环路 | 第19-20页 |
| 1.2.4 腺相关病毒的生物学特性及其应用 | 第20-22页 |
| 1.2.4.1 腺相关病毒的生物学特性及其包装制备 | 第20-21页 |
| 1.2.4.2 对cap基因的定向改造 | 第21-22页 |
| 2.目的与意义 | 第22-23页 |
| 3.材料和方法 | 第23-45页 |
| 3.1 实验材料 | 第23-24页 |
| 3.1.1 质粒、菌株、细胞系及实验动物 | 第23页 |
| 3.1.2 主要药品、试剂、仪器 | 第23页 |
| 3.1.3 培养基、缓冲液成分 | 第23-24页 |
| 3.2 实验方法 | 第24-45页 |
| 3.2.1 AAV核心质粒的改造及构建 | 第24-29页 |
| 3.2.1.1 PCR扩增反应体系及条件 | 第24-25页 |
| 3.2.1.2 质粒酶切反应体系及条件 | 第25页 |
| 3.2.1.3 DNA琼脂糖凝胶电泳 | 第25-26页 |
| 3.2.1.4 DNA凝胶回收试剂盒使用方法 | 第26页 |
| 3.2.1.5 DNA同源重组连接方法 | 第26-27页 |
| 3.2.1.6 CaCl_2法大肠杆菌感受态的制备 | 第27页 |
| 3.2.1.7 菌落PCR鉴定阳性克隆反应体系及方法 | 第27-28页 |
| 3.2.1.8 普通分子克隆所需质粒抽提试剂盒使用方法 | 第28-29页 |
| 3.2.2 腺相关病毒的制备 | 第29-34页 |
| 3.2.2.1 去内毒素质粒抽提方法 | 第29-30页 |
| 3.2.2.2 HEK-293T细胞的复苏、传代培养及冻存方法 | 第30-32页 |
| 3.2.2.3 细胞转染及AAV包装方法 | 第32-33页 |
| 3.2.2.4 AAV收毒方法 | 第33页 |
| 3.2.2.5 基于qPCR的AAV病毒效价测定方法 | 第33-34页 |
| 3.2.3 鼠脑立体定位注射、取脑及脑切片 | 第34-36页 |
| 3.2.3.1 鼠脑立体定位注射 | 第34-35页 |
| 3.2.3.2 小鼠心脏灌注处死及取脑 | 第35-36页 |
| 3.2.3.3 鼠脑琼脂糖包埋及震荡切片 | 第36页 |
| 3.2.4 分离带标记细胞核实验流程 | 第36-37页 |
| 3.2.4.1 密度梯度离心法分离细胞核 | 第36-37页 |
| 3.2.4.2 免疫共沉淀分离被标记细胞核 | 第37页 |
| 3.2.4.3 利用ImageJ软件统计细胞核阳性率 | 第37页 |
| 3.2.5 单细胞DNA甲基化测序建库方法 | 第37-42页 |
| 3.2.5.1 DNA亚硫酸盐转化及纯化 | 第37-39页 |
| 3.2.5.2 预扩增 | 第39-40页 |
| 3.2.5.3 外切酶消化 | 第40页 |
| 3.2.5.4 预扩增产物的纯化 | 第40页 |
| 3.2.5.5 Adaptor2的添加 | 第40-41页 |
| 3.2.5.6 双接头产物的纯化 | 第41页 |
| 3.2.5.7 DNA甲基化测序文库的PCR扩增 | 第41-42页 |
| 3.2.5.8 DNA甲基化测序文库的纯化及洗脱 | 第42页 |
| 3.2.5.9 琼脂糖凝胶电泳鉴定文库质量 | 第42页 |
| 3.2.6 DNA甲基化测序数据的生物信息分析流程 | 第42-45页 |
| 3.2.6.1 采用fastqc软件对测序数据质检 | 第42页 |
| 3.2.6.2 采用trimmomatic软件滤除低可信度序列及接头序列 | 第42-43页 |
| 3.2.6.3 采用bismark_genome_preparation软件转换参考基因组 | 第43页 |
| 3.2.6.4 采用bismark软件进行序列比对 | 第43页 |
| 3.2.6.5 采用deduplicate_bismark滤除冗余的比对结果 | 第43-44页 |
| 3.2.6.6 利用bismark_methylation_extractor软件提取DNA甲基化信息 | 第44-45页 |
| 4.结果与分析 | 第45-62页 |
| 4.1 对INTACT技术实验条件的摸索与完善 | 第45-54页 |
| 4.2 其他AAV示踪工具的构建与功能验证 | 第54-56页 |
| 4.3 单细胞DNA甲基化测序建库及生信分析 | 第56-61页 |
| 4.4 总结 | 第61-62页 |
| 5.讨论与展望 | 第62-64页 |
| 5.1 AAV载体容量的扩增 | 第62-63页 |
| 5.2 单细胞DNA甲基化分析在医学检测的应用 | 第63-64页 |
| 参考文献 | 第64-69页 |
| 致谢 | 第69页 |
