| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 第一章 绪论 | 第10-17页 |
| 1.1 麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)概述 | 第10-12页 |
| 1.1.1 MTSase的简介 | 第10页 |
| 1.1.2 MTSase的结构及催化机理 | 第10-11页 |
| 1.1.3 MTSase的研究进展 | 第11-12页 |
| 1.2 海藻糖的概述 | 第12-14页 |
| 1.2.1 海藻糖简介 | 第12-13页 |
| 1.2.2 海藻糖的制备方法 | 第13-14页 |
| 1.2.3 海藻糖的应用 | 第14页 |
| 1.3 酶分子改造 | 第14-16页 |
| 1.3.1 理性设计 | 第14页 |
| 1.3.2 非理性设计 | 第14-15页 |
| 1.3.3 半理性设计 | 第15-16页 |
| 1.4 立题依据及意义 | 第16页 |
| 1.5 本论文的主要研究内容 | 第16-17页 |
| 第二章 材料与方法 | 第17-33页 |
| 2.1 实验材料 | 第17-19页 |
| 2.1.1 菌种、质粒及基因 | 第17页 |
| 2.1.2 药品及试剂 | 第17-18页 |
| 2.1.3 主要仪器 | 第18-19页 |
| 2.1.4 培养基 | 第19页 |
| 2.2 高通量筛选方法的建立与优化 | 第19-20页 |
| 2.2.1 高通量筛选体系的底物浓度优化 | 第19页 |
| 2.2.2 MTSase的高通量筛选方法的建立 | 第19-20页 |
| 2.3 基因工程相关操作方法 | 第20-28页 |
| 2.3.1 质粒抽提 | 第20页 |
| 2.3.2 MTSase基因的易错PCR | 第20-21页 |
| 2.3.3 易错PCR产物与表达载体pET-24a(+)的酶切与连接 | 第21-22页 |
| 2.3.4 E.coli感受态细胞的制备 | 第22页 |
| 2.3.5 E.coli感受态细胞的热激转化 | 第22-23页 |
| 2.3.6 突变文库的构建 | 第23页 |
| 2.3.7 MTSase的定点突变 | 第23-25页 |
| 2.3.8 MTSase的饱和突变 | 第25-26页 |
| 2.3.9 MTSase的叠加突变 | 第26-28页 |
| 2.4 MTSase突变文库的高通量筛选 | 第28页 |
| 2.4.1 初筛 | 第28页 |
| 2.4.2 复筛 | 第28页 |
| 2.5 MTSase及其突变体的酶学定性 | 第28-30页 |
| 2.5.1 MTSase及其突变体的表达 | 第28页 |
| 2.5.2 SDS-PAGE电泳分析 | 第28-29页 |
| 2.5.3 MTSase及其突变体的分离纯化 | 第29页 |
| 2.5.4 蛋白浓度测定 | 第29页 |
| 2.5.5 酶活力测定 | 第29页 |
| 2.5.6 酶学性质探究 | 第29-30页 |
| 2.5.7 动力学常数的测定 | 第30页 |
| 2.6 分子模拟 | 第30-31页 |
| 2.7 发酵方法 | 第31-32页 |
| 2.7.1 MTSase及其突变体的摇瓶发酵 | 第31页 |
| 2.7.2 MTSase及其突变体的3.6L罐发酵 | 第31-32页 |
| 2.8 MTSase及其突变体制备海藻糖应用探究 | 第32页 |
| 2.9 酶转化产物检测 | 第32-33页 |
| 第三章 结果与讨论 | 第33-51页 |
| 3.1 MTSase高通量筛选(HTS)方法的建立与第一轮筛选 | 第33-39页 |
| 3.1.1 底物浓度对高通量筛选的影响 | 第33页 |
| 3.1.2 高通量筛选方法的建立 | 第33-34页 |
| 3.1.3 MTSase基因的易错PCR条件的确定 | 第34-35页 |
| 3.1.4 MTSase突变文库的构建 | 第35页 |
| 3.1.5 MTSase的高通量筛选 | 第35-36页 |
| 3.1.6 MTSase及其突变体的蛋白纯化 | 第36-37页 |
| 3.1.7 MTSase及其突变体酶学性质探究 | 第37-39页 |
| 3.2 MTSase的第二轮高通量筛选 | 第39-43页 |
| 3.2.1 MTSase的高通量筛选 | 第39-40页 |
| 3.2.2 突变体的蛋白纯化 | 第40页 |
| 3.2.3 突变体酶学性质探究 | 第40-43页 |
| 3.3 MTSase突变位点分析 | 第43-48页 |
| 3.3.1 MTSase的定点突变 | 第43-44页 |
| 3.3.2 MTSase的饱和突变 | 第44页 |
| 3.3.3 突变体F284V、T439A比活力测定 | 第44-45页 |
| 3.3.4 MTSase的叠加突变 | 第45页 |
| 3.3.5 突变体分子模拟及分析 | 第45-48页 |
| 3.4 MTSase及其突变体3.6L罐发酵和制备海藻糖探究 | 第48-51页 |
| 3.4.1 MTSase及其突变体的3.6L罐发酵 | 第48-50页 |
| 3.4.2 MTSase及其突变体制备海藻糖应用探究 | 第50-51页 |
| 主要结论和展望 | 第51-53页 |
| 主要结论 | 第51-52页 |
| 展望 | 第52-53页 |
| 致谢 | 第53-54页 |
| 参考文献 | 第54-59页 |
| 附录:作者在攻读硕士学位期间发表的论文 | 第59页 |
