| 符号说明 | 第4-9页 |
| 中文摘要 | 第9-11页 |
| Abstract | 第11-13页 |
| 1 前言 | 第14-23页 |
| 1.1 RNA沉默 | 第14-17页 |
| 1.1.1 RNA沉默的发现 | 第14页 |
| 1.1.2 RNA沉默的作用机制 | 第14-16页 |
| 1.1.3 参与RNA沉默的主要细胞组分 | 第16-17页 |
| 1.1.3.1 DICER | 第16页 |
| 1.1.3.2 AGO蛋白 | 第16-17页 |
| 1.1.3.3 RNA依赖的RNA聚合酶 | 第17页 |
| 1.2 RNA沉默与病毒抗性 | 第17-19页 |
| 1.2.1 RNA沉默介导病毒抗性的特点 | 第18页 |
| 1.2.2 RNA沉默介导病毒抗性策略 | 第18-19页 |
| 1.3 马立克氏病病毒Meq基因 | 第19-22页 |
| 1.3.1 Ⅰ型马立克氏病病毒 | 第19-20页 |
| 1.3.2 Meq基因 | 第20-22页 |
| 1.4 本研究的目的和意义 | 第22-23页 |
| 2 材料与方法 | 第23-46页 |
| 2.1 实验材料 | 第23-24页 |
| 2.1.1 植物材料 | 第23页 |
| 2.1.2 病毒毒源 | 第23页 |
| 2.1.3 菌株、质粒 | 第23页 |
| 2.1.4 酶与各种生化试剂 | 第23页 |
| 2.1.5 实验仪器 | 第23-24页 |
| 2.1.6 PCR引物 | 第24页 |
| 2.2 实验方法 | 第24-46页 |
| 2.2.1 植物材料管理 | 第24页 |
| 2.2.2 病毒RNA的提取 | 第24-25页 |
| 2.2.3 cDNA的合成 | 第25页 |
| 2.2.4 基因的克隆及其载体构建 | 第25-30页 |
| 2.2.4.1 PCR扩增及鉴定 | 第25-27页 |
| 2.2.4.2 酶切和回收 | 第27页 |
| 2.2.4.3 连接反应 | 第27-28页 |
| 2.2.4.4 大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第28页 |
| 2.2.4.5 质粒DNA的微量提取 | 第28-29页 |
| 2.2.4.6 质粒DNA向大肠杆菌中的转化 | 第29页 |
| 2.2.4.7 重组质粒向农杆菌中的转化 | 第29-30页 |
| 2.2.4.8 转化菌落的PCR鉴定 | 第30页 |
| 2.2.4.9 测序鉴定 | 第30页 |
| 2.2.5 农杆菌介导的瞬时表达系统及其沉默现象的观察 | 第30-31页 |
| 2.2.5.1 农杆菌介导的瞬时表达体系 | 第30页 |
| 2.2.5.2 长波紫外灯下沉默现象的观察 | 第30-31页 |
| 2.2.6 定点突变 | 第31页 |
| 2.2.7 农杆菌介导的烟草转化 | 第31-32页 |
| 2.2.8 农杆菌介导的拟南芥转化 | 第32页 |
| 2.2.9 CTAB法提取植物总DNA | 第32-33页 |
| 2.2.10 转基因植株的抗病性鉴定及ELISA检测 | 第33-34页 |
| 2.2.10.1 转基因植株病毒接种及抗病性鉴定 | 第33页 |
| 2.2.10.2 ELISA检测 | 第33-34页 |
| 2.2.11 总RNA Northern blot检测 | 第34-38页 |
| 2.2.11.1 热酚法提取植物的总RNA | 第34页 |
| 2.2.11.2 总RNA的甲醛变性凝胶电泳 | 第34-35页 |
| 2.2.11.3 总RNA的转膜 | 第35页 |
| 2.2.11.4 地高辛标记Northern blot | 第35-38页 |
| 2.2.12 小分子RNA的Northern blot检测 | 第38-41页 |
| 2.2.12.1 热酚法提取植物小分子RNA | 第38-39页 |
| 2.2.12.2 尿素/聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第39-40页 |
| 2.2.12.3 小分子RNA的转膜 | 第40-41页 |
| 2.2.12.4 小分子RNA的杂交 | 第41页 |
| 2.2.13 qRT-PCR | 第41-44页 |
| 2.2.13.1 TRIZOL提取烟草总RNA(同上) | 第41页 |
| 2.2.13.2 RNA反转录 | 第41页 |
| 2.2.13.3 qRT-PCR引物设计 | 第41-43页 |
| 2.2.13.4 qRT-PCR反应条件 | 第43-44页 |
| 2.2.14 MEQ蛋白的亚细胞定位 | 第44-46页 |
| 2.2.14.1 瞬时侵染洋葱 | 第44页 |
| 2.2.14.2 利用荧光显微镜(OLYMPUS)观察组织细胞内荧光的位置 | 第44-46页 |
| 3 结果与分析 | 第46-64页 |
| 3.1 Meq基因的克隆及载体构建 | 第46-47页 |
| 3.1.1 克隆载体的构建 | 第46页 |
| 3.1.2 植物双元表达载体的构建 | 第46-47页 |
| 3.2 Meq基因增强瞬时侵染介导的局部RNA沉默 | 第47-49页 |
| 3.3 Meq基因增强系统性RNA沉默 | 第49-50页 |
| 3.4 MEQ的突变分析 | 第50-56页 |
| 3.4.1 MEQ突变体的设计 | 第50-51页 |
| 3.4.2 Meq基因突变体的获得及载体构建 | 第51-52页 |
| 3.4.3 Meq基因各缺失突变体RNA沉默增强能力分析 | 第52-55页 |
| 3.4.4 Meq基因各点突变体RNA沉默增强能力分析 | 第55-56页 |
| 3.5 MEQ亚细胞定位分析 | 第56-58页 |
| 3.5.1 MEQ与GFP蛋白融合表达载体的构建 | 第56-58页 |
| 3.5.2 MEQ-GFP融合蛋白的亚细胞定位 | 第58页 |
| 3.6 Meq基因对沉默途径相关基因的影响 | 第58-59页 |
| 3.7 Meq转基因植株的病毒抗性分析 | 第59-64页 |
| 3.7.1 Meq转基因烟草的病毒抗性分析 | 第59-62页 |
| 3.7.1.1 转基因烟草的获得 | 第59-60页 |
| 3.7.1.2 转基因烟草的PCR检测 | 第60页 |
| 3.7.1.3 转基因烟草的病毒抗性分析 | 第60-62页 |
| 3.7.1.4 转基因烟草的Northern杂交分析 | 第62页 |
| 3.7.2 Meq转基因拟南芥的病毒抗性分析 | 第62-64页 |
| 3.7.2.1 转基因拟南芥的获得 | 第62-63页 |
| 3.7.2.2 转基因拟南芥的抗病性分析 | 第63-64页 |
| 4 讨论 | 第64-68页 |
| 4.1 MEQ可能在病毒与寄主的兼容互作中起作用 | 第64页 |
| 4.2 MEQ增强RNA沉默的作用方式 | 第64-65页 |
| 4.3 MEQ参与沉默途径的机制分析 | 第65-66页 |
| 4.4 MEQ介导的抗病性 | 第66-68页 |
| 5 结论 | 第68-69页 |
| 参考文献 | 第69-76页 |
| 致谢 | 第76页 |
