| 摘要 | 第8-10页 |
| ABSTRACT | 第10-11页 |
| 符号说明 | 第12-13页 |
| 上篇 文献综述 | 第13-25页 |
| 第一章 副猪嗜血杆菌概述 | 第13-25页 |
| 1 副猪嗜血杆菌病流行病学 | 第13-14页 |
| 1.1 副猪嗜血杆菌生物学特征 | 第13页 |
| 1.2 副猪嗜血杆菌病 | 第13-14页 |
| 1.3 副猪嗜血杆菌血清型研究 | 第14页 |
| 2 副猪嗜血杆菌病的发病机理 | 第14-15页 |
| 3 副猪嗜血杆菌病的临诊症状 | 第15页 |
| 4 副猪嗜血杆菌病的病理变化 | 第15页 |
| 5 副猪嗜血杆菌的潜在毒力相关因子 | 第15-21页 |
| 5.1 脂寡糖(LOS) | 第15-16页 |
| 5.2 外膜蛋白(OMP) | 第16页 |
| 5.3 转铁结合蛋白 | 第16-17页 |
| 5.4 菌毛 | 第17页 |
| 5.5 细胞致死膨胀毒素(CDT) | 第17-18页 |
| 5.6 V型分泌系统(T5SS) | 第18-19页 |
| 5.7 神经氨酸酶(NA) | 第19-20页 |
| 5.8 Mu噬菌体 | 第20页 |
| 5.9 其它毒力相关因子 | 第20-21页 |
| 6 细菌荚膜及其相关基因的研究 | 第21-25页 |
| 下篇 研究内容 | 第25-65页 |
| 第二章 浙江省副猪嗜血杆菌血清型调查 | 第25-37页 |
| 1 材料 | 第26-27页 |
| 1.1 菌株 | 第26-27页 |
| 1.2 主要试剂 | 第27页 |
| 2 方法 | 第27-30页 |
| 2.1 血清型鉴定 | 第27-29页 |
| 2.1.1 细菌复苏 | 第27页 |
| 2.1.2 细菌DNA提取 | 第27页 |
| 2.1.3 血清型鉴定引物 | 第27-28页 |
| 2.1.4 血清型鉴定PCR扩增 | 第28-29页 |
| 2.1.5 统计分析 | 第29页 |
| 2.2 副猪嗜血杆菌毒力基因检测 | 第29-30页 |
| 2.2.1 相关毒力基因扩增引物 | 第29-30页 |
| 2.2.2 细菌DNA | 第30页 |
| 2.2.3 PCR扩增 | 第30页 |
| 3 结果与分析 | 第30-35页 |
| 3.1 副猪嗜血杆菌分离鉴定结果 | 第30页 |
| 3.2 副猪嗜血杆菌的不同血清型鉴定PCR扩增结果 | 第30页 |
| 3.3 不同猪场中副猪嗜血杆菌血清型鉴定情况 | 第30-31页 |
| 3.4 各血清型的检出率 | 第31页 |
| 3.5 不同年份副猪嗜血杆菌血清型鉴定结果 | 第31-32页 |
| 3.6 不同血清型中毒力基因检测结果 | 第32-35页 |
| 4 讨论 | 第35-37页 |
| 第三章 IscR基因缺失对副猪嗜血杆菌荚膜多糖合成基因簇中部分相关基因表达的影响 | 第37-49页 |
| 1 材料 | 第38页 |
| 1.1 菌株 | 第38页 |
| 1.2 酶和试剂 | 第38页 |
| 2 方法 | 第38-42页 |
| 2.1 引物设计与合成 | 第38-39页 |
| 2.2 细菌培养 | 第39页 |
| 2.3 细菌DNA提取 | 第39页 |
| 2.4 血清型鉴定 | 第39页 |
| 2.5 总RNA提取 | 第39-40页 |
| 2.6 去除基因组DNA及RT-PCR | 第40-41页 |
| 2.7 细菌与猪血清作用 | 第41页 |
| 2.8 透射电镜 | 第41-42页 |
| 2.9 数据分析 | 第42页 |
| 3 结果与分析 | 第42-47页 |
| 3.1 290A1菌株血清型鉴定结果 | 第42页 |
| 3.2 不同生长时期荚膜多糖相关基因的表达情况 | 第42-44页 |
| 3.3 与猪血清作用过程中荚膜多糖相关基因的表达量变化 | 第44-46页 |
| 3.4 透射电镜结果 | 第46-47页 |
| 4 讨论 | 第47-49页 |
| 第四章 副猪嗜血杆菌IscR蛋白结合靶位点的探索 | 第49-65页 |
| 1 材料 | 第49-50页 |
| 1.1 菌株 | 第49页 |
| 1.2 主要试剂 | 第49-50页 |
| 1.3 引物 | 第50页 |
| 2 方法 | 第50-60页 |
| 2.1 IscR纯化蛋白的制备 | 第50-53页 |
| 2.1.1 IscR基因扩增 | 第50-51页 |
| 2.1.2 IscR DNA纯化回收 | 第51页 |
| 2.1.3 DNA及质粒双酶切 | 第51页 |
| 2.1.4 基因与载体连接 | 第51-52页 |
| 2.1.5 重组质粒回收及酶切验证 | 第52页 |
| 2.1.6 IscR蛋白表达 | 第52页 |
| 2.1.7 IscR蛋白纯化 | 第52-53页 |
| 2.2 capD和wza启动子的核酸探针制备 | 第53-55页 |
| 2.2.1 290AI基因组DNA提取 | 第53页 |
| 2.2.2 启动子的PCR扩增 | 第53页 |
| 2.2.3 DNA纯化回收及与pMD19T的连接与转化 | 第53-54页 |
| 2.2.4 菌液PCR鉴定及测序 | 第54页 |
| 2.2.5 核酸探针生物素标记 | 第54-55页 |
| 2.3 电泳迁移改变试验(EMSA) | 第55-58页 |
| 2.3.1 配制EMSA胶 | 第55页 |
| 2.3.2 EMSA结合反应 | 第55-56页 |
| 2.3.3 电泳 | 第56页 |
| 2.3.4 转膜 | 第56-57页 |
| 2.3.5 交联 | 第57页 |
| 2.3.6 化学发光 | 第57-58页 |
| 2.4 IscR蛋白的多抗血清制备 | 第58页 |
| 2.4.1 BCA试剂盒测定纯化的IscR蛋白的浓度 | 第58页 |
| 2.4.2 免疫实验兔获得多抗血清 | 第58页 |
| 2.5 IscR蛋白与多抗血清的Western blot鉴定 | 第58-59页 |
| 2.5.1 样品制备 | 第58页 |
| 2.5.2 Western blot鉴定 | 第58-59页 |
| 2.6 HPs自身体外表达IscR蛋白的检测 | 第59-60页 |
| 2.6.1 290A1菌株复苏 | 第59-60页 |
| 2.6.2 52A13-IscR菌液培养 | 第60页 |
| 2.6.3 样品制备及Western blot | 第60页 |
| 3 结果 | 第60-63页 |
| 3.1 IscR基因的PCR扩增 | 第60页 |
| 3.2 p-capD和p-wza的PCR扩增结果 | 第60-61页 |
| 3.3 IscR原核表达及纯化结果 | 第61-62页 |
| 3.4 EMSA试验结果 | 第62-63页 |
| 3.5 IscR蛋白与多抗血清的Western blot的鉴定结果 | 第63页 |
| 3.6 HPs自身体外表达IscR蛋白的检测结果 | 第63页 |
| 4 讨论 | 第63-65页 |
| 参考文献 | 第65-75页 |
| 全文总结 | 第75-77页 |
| 附录 | 第77-81页 |
| 致谢 | 第81-83页 |
| 在读硕士期间发表的论文 | 第83页 |
