| 摘要 | 第5-7页 |
| Abstract | 第7-8页 |
| 第一章 绪论 | 第14-26页 |
| 1.1 酵母糖代谢途径介绍 | 第14-16页 |
| 1.2 乙醇生产现状 | 第16页 |
| 1.3 表面展示技术介绍 | 第16-24页 |
| 1.3.1 宿主细胞 | 第17-20页 |
| 1.3.1.1 噬菌体 | 第17-19页 |
| 1.3.1.2 细菌 | 第19页 |
| 1.3.1.3 酵母 | 第19-20页 |
| 1.3.2 锚定蛋白 | 第20-24页 |
| 1.3.2.1 非共价型锚定蛋白 | 第20-21页 |
| 1.3.2.2 共价型锚定蛋白 | 第21-24页 |
| 1.4 本论文研究的内容和意义 | 第24-26页 |
| 第二章 丙酮酸脱羧酶与乙醇脱氢酶重组菌构建 | 第26-55页 |
| 2.1 实验材料 | 第26-31页 |
| 2.1.1 菌株与质粒 | 第26页 |
| 2.1.2 主要仪器设备 | 第26页 |
| 2.1.3 主要试剂 | 第26-27页 |
| 2.1.4 主要溶液配方 | 第27-29页 |
| 2.1.4.1 酵母基因组提取相关试剂 | 第27页 |
| 2.1.4.2 相关抗生素母液 | 第27页 |
| 2.1.4.3 电泳相关试剂 | 第27页 |
| 2.1.4.4 制备感受态细胞的相关试剂 | 第27-28页 |
| 2.1.4.5 诱导培养相关试剂 | 第28页 |
| 2.1.4.6 荧光检测试剂 | 第28页 |
| 2.1.4.7 细胞壁蛋白提取试剂 | 第28-29页 |
| 2.1.4.8 Western检测相关试剂 | 第29页 |
| 2.1.5 主要培养基配方 | 第29-31页 |
| 2.2 实验流程 | 第31-32页 |
| 2.3 实验方法 | 第32-44页 |
| 2.3.1 获取目的基因片段 | 第32-34页 |
| 2.3.1.1 Saccharomyces cerevisiae S288c基因组DNA提取 | 第32-33页 |
| 2.3.1.2 扩增PDC,ADH及各自对应的Pir目的片段 | 第33-34页 |
| 2.3.1.3 胶回收目的基因片段 | 第34页 |
| 2.3.2 连接pMD18-T载体 | 第34-35页 |
| 2.3.3 转化大肠杆菌DH5α感受态细胞 | 第35页 |
| 2.3.4 重组转化子筛选 | 第35-37页 |
| 2.3.4.1 菌落PCR验证 | 第35-36页 |
| 2.3.4.2 双酶切验证 | 第36-37页 |
| 2.3.4.3 测序验证 | 第37页 |
| 2.3.5 连接pPIC9k质粒 | 第37-39页 |
| 2.3.5.1 获取四种目的片段 | 第37-38页 |
| 2.3.5.2 获取pPIC9k片段 | 第38页 |
| 2.3.5.3 回收片段的浓度测定 | 第38页 |
| 2.3.5.4 目的片段与pPIC9k载体片段连接 | 第38-39页 |
| 2.3.6 转化大肠杆菌DH5α感受态细胞 | 第39页 |
| 2.3.7 阳性重组pPIC9k筛选 | 第39页 |
| 2.3.7.1 菌落PCR验证 | 第39页 |
| 2.3.7.2 双酶切验证 | 第39页 |
| 2.3.7.3 测序验证 | 第39页 |
| 2.3.8 电转化毕赤酵母GS115感受态 | 第39-40页 |
| 2.3.8.1 毕赤酵母感受态细胞的制备 | 第39-40页 |
| 2.3.8.2 电转操作 | 第40页 |
| 2.3.9 多拷贝转化子筛选 | 第40-41页 |
| 2.3.9.1 G418抗性平板筛选 | 第40-41页 |
| 2.3.9.2 多拷贝转化子的基因组PCR验证 | 第41页 |
| 2.3.10 多拷贝转化子表达验证 | 第41-44页 |
| 2.3.10.1 多拷贝转化子的诱导表达 | 第41页 |
| 2.3.10.2 免疫荧光显微镜观察 | 第41-42页 |
| 2.3.10.3 Western Bolt验证 | 第42-44页 |
| 2.4 结果和分析 | 第44-55页 |
| 2.4.1 酿酒酵母S288c基因组DNA提取 | 第44-45页 |
| 2.4.2 PDC,ADH及各自对应的Pir目的片段的扩增 | 第45页 |
| 2.4.3 重组T载体菌落PCR及双酶切验证 | 第45-47页 |
| 2.4.4 PDC,ADH重组9k载体菌落PCR和双酶切验证 | 第47-50页 |
| 2.4.5 多拷贝转化子筛选及鉴定 | 第50-52页 |
| 2.4.6 免疫荧光镜检及Western blot检验 | 第52-55页 |
| 第三章 酵母乙醇产生途径中其它酶表面展示体系的构建 | 第55-88页 |
| 3.1 实验材料 | 第55页 |
| 3.1.1 菌株与质粒 | 第55页 |
| 3.1.2 主要仪器设备 | 第55页 |
| 3.1.3 主要试剂 | 第55页 |
| 3.1.4 主要溶液配方 | 第55页 |
| 3.1.5 主要培养基配方 | 第55页 |
| 3.2 实验流程 | 第55-57页 |
| 3.3 实验方法 | 第57-63页 |
| 3.3.1 获取目的基因片段 | 第57-58页 |
| 3.3.1.1 S.cerevisiae S288c基因组DNA提取 | 第57页 |
| 3.3.1.2 扩增乙醇产生途径中的相关基因 | 第57-58页 |
| 3.3.1.3 胶回收糖酵解基因片段 | 第58页 |
| 3.3.2 连接pMD 18-T载体 | 第58页 |
| 3.3.3 转化大肠杆菌DH5α感受态细胞 | 第58页 |
| 3.3.4 重组转化子筛选 | 第58-59页 |
| 3.3.4.1 菌落PCR验证 | 第58页 |
| 3.3.4.2 双酶切验证 | 第58-59页 |
| 3.3.4.3 测序验证 | 第59页 |
| 3.3.5 连接pPIC9k质粒 | 第59-60页 |
| 3.3.5.1 获取目的片段 | 第59页 |
| 3.3.5.2 获取pPIC9k片段 | 第59页 |
| 3.3.5.3 回收片段的浓度测定 | 第59页 |
| 3.3.5.4 目的片段与pPIC9k载体片段连接 | 第59-60页 |
| 3.3.6 转化大肠杆菌DH5α感受态细胞 | 第60页 |
| 3.3.7 阳性重组pPIC9k筛选 | 第60页 |
| 3.3.7.1 菌落PCR验证 | 第60页 |
| 3.3.7.2 双酶切验证 | 第60页 |
| 3.3.7.3 测序验证 | 第60页 |
| 3.3.8 电转化毕赤酵母GS115感受态 | 第60-61页 |
| 3.3.8.1 毕赤酵母感受态细胞的制备 | 第60-61页 |
| 3.3.8.2 电转操作 | 第61页 |
| 3.3.9 多拷贝转化子筛选 | 第61页 |
| 3.3.9.1 G418抗性平板筛选 | 第61页 |
| 3.3.9.2 多拷贝转化子的基因组PCR验证 | 第61页 |
| 3.3.10 多拷贝转化子表达验证 | 第61-62页 |
| 3.3.10.1 多拷贝转化子的诱导表达 | 第61页 |
| 3.3.10.2 免疫荧光显微镜观察 | 第61页 |
| 3.3.10.3 Western Bolt验证 | 第61-62页 |
| 3.3.11 重组子的遗传稳定性验证 | 第62-63页 |
| 3.4 实验结果 | 第63-88页 |
| 3.4.1 酿酒酵母S288c基因组DNA提取 | 第63页 |
| 3.4.2 目的基因扩增 | 第63-65页 |
| 3.4.3 重组T载体PCR及双酶切验证图 | 第65-70页 |
| 3.4.4 糖酵解酶类的重组9k载体菌落PCR和双酶切验证 | 第70-75页 |
| 3.4.5 多拷贝转化子筛选及鉴定 | 第75-80页 |
| 3.4.6 免疫荧光镜检及Western blot检验 | 第80-86页 |
| 3.4.7 遗传稳定性验证 | 第86-88页 |
| 结论 | 第88-89页 |
| 讨论 | 第89-93页 |
| 附录 | 第93-94页 |
| 参考文献 | 第94-100页 |
| 硕士期间发表的论文和参加的学术活动 | 第100-101页 |
| 致谢 | 第101页 |
