| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 常用英文缩略词表 | 第7-11页 |
| 1.前言 | 第11-19页 |
| 1.1 IBD病原学研究进展 | 第11-12页 |
| 1.1.1 血清型和致病性 | 第11页 |
| 1.1.2 IBDV基因组及病毒结构 | 第11-12页 |
| 1.2 IBD疫苗 | 第12-15页 |
| 1.2.1 弱毒疫苗 | 第13页 |
| 1.2.2 灭活苗 | 第13页 |
| 1.2.3 基因工程疫苗 | 第13-14页 |
| 1.2.4 DNA疫苗 | 第14-15页 |
| 1.3 我国IBD防控中的问题 | 第15页 |
| 1.4 细胞因子免疫调节剂 | 第15-16页 |
| 1.5 Akirins研究进展 | 第16-17页 |
| 1.6 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）在疫苗研发中的应用 | 第17页 |
| 1.7 杆状病毒表达系统 | 第17-19页 |
| 2. 材料和方法 | 第19-37页 |
| 2.1 主要仪器和试剂 | 第19-22页 |
| 2.1.1 主要仪器设备 | 第19-20页 |
| 2.1.2 主要试剂和材料 | 第20-21页 |
| 2.1.3 实验室试剂配制 | 第21-22页 |
| 2.2 基因优化与合成 | 第22-23页 |
| 2.3 引物设计与合成 | 第23-24页 |
| 2.4 VP2、Akirin2和GM-CSF共表达重组质粒pVP2-Akirin2-GM-CSF的构建 | 第24-28页 |
| 2.4.1 PCR扩增VP2-Akirin2-GM-CSF基因 | 第24页 |
| 2.4.2 PCR产物纯化 | 第24-25页 |
| 2.4.3 双酶切 | 第25页 |
| 2.4.4 连接 | 第25-26页 |
| 2.4.5 连接产物的转化 | 第26页 |
| 2.4.6 菌落PCR鉴定 | 第26-27页 |
| 2.4.7 阳性菌落质粒双酶切鉴定 | 第27-28页 |
| 2.4.8 基因序列分析验证 | 第28页 |
| 2.5 重组质粒pVP2、pAkirin2、pGM-CSF、pVP2-Akirin2和pVP2-GM-CSF的构建 | 第28页 |
| 2.6 His-VP2融合蛋白的制备 | 第28-32页 |
| 2.6.1 重组杆状病毒Bac-VP2的构建 | 第28-30页 |
| 2.6.2 重组杆状病毒的鉴定—IFA检测 | 第30页 |
| 2.6.3 蛋白纯化及鉴定 | 第30-32页 |
| 2.7 间接ELISA检测血清VP2抗体方法的建立 | 第32-33页 |
| 2.7.1 间接ELISA操作步骤 | 第32页 |
| 2.7.2 间接ELISA条件优化 | 第32页 |
| 2.7.3 特异性试验 | 第32页 |
| 2.7.4 样品检测 | 第32-33页 |
| 2.8 重组质粒体外表达 | 第33页 |
| 2.8.1 体外转染 293T细胞 | 第33页 |
| 2.8.2 SDS-PAGE和Western-blot检测 | 第33页 |
| 2.9 攻毒保护试验 | 第33-37页 |
| 2.9.1 攻毒剂量的确定 | 第33-34页 |
| 2.9.2 重组质粒免疫剂量的确定 | 第34页 |
| 2.9.3 动物试验分组 | 第34-35页 |
| 2.9.4 病变保护率 | 第35页 |
| 2.9.5 抗体水平检测 | 第35页 |
| 2.9.6 外周血淋巴细胞增殖试验(MTT法) | 第35-36页 |
| 2.9.7 血清IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6 浓度测定 | 第36-37页 |
| 2.10数据统计 | 第37页 |
| 3. 结果 | 第37-52页 |
| 3.1 PCR扩增结果 | 第37-38页 |
| 3.2 重组质粒双酶切鉴定结果 | 第38-39页 |
| 3.3 重组杆状病毒Bac-VP2的IFA鉴定结果 | 第39页 |
| 3.4 His-VP2蛋白SDS-PAGE和Western blot鉴定结果 | 第39-40页 |
| 3.5 重组质粒在 293T细胞中的表达结果 | 第40-42页 |
| 3.6 间接ELISA检测血清VP2抗体水平检测方法的建立 | 第42-44页 |
| 3.6.1 最适抗原包被浓度和最适血清稀释度的确定 | 第42页 |
| 3.6.2 间接ELISA条件优化结果 | 第42-43页 |
| 3.6.3 间接ELISA判定标准的确定 | 第43-44页 |
| 3.6.4 交叉反应检测结果 | 第44页 |
| 3.6.5 血清样品检测结果 | 第44页 |
| 3.7 攻毒保护试验结果 | 第44-46页 |
| 3.7.1 攻毒剂量的确定 | 第44页 |
| 3.7.2 免疫剂量的确定 | 第44-45页 |
| 3.7.3 攻毒保护试验结果 | 第45-46页 |
| 3.8 抗体水平检测结果 | 第46-48页 |
| 3.8.1 间接ELISA检测血清VP2抗体水平 | 第46-47页 |
| 3.8.2 中和抗体滴度检测结果 | 第47-48页 |
| 3.9 外周血淋巴细胞增殖试验（MTT法）结果 | 第48-49页 |
| 3.10血清IFN-γ、IL-2、IL-4 和IL-6 浓度检测结果 | 第49-52页 |
| 3.10.1 血清IFN-γ 浓度检测结果 | 第49页 |
| 3.10.2 血清IL-2 浓度检测结果 | 第49-50页 |
| 3.10.3 血清IL-4 浓度检测结果 | 第50-51页 |
| 3.10.4 血清IL-6 浓度检测结果 | 第51-52页 |
| 4 讨论 | 第52-56页 |
| 4.1 目的基因的选择 | 第52-53页 |
| 4.2 真核表达载体的选择 | 第53页 |
| 4.3 IBDV VP2抗体ELISA检测方法的建立 | 第53-54页 |
| 4.4 IBD DNA疫苗免疫保护力评价 | 第54页 |
| 4.5 Akirin2和GM-CSF对VP2 DNA疫苗佐剂效应分析 | 第54-56页 |
| 5 结论 | 第56-58页 |
| 致谢 | 第58-59页 |
| 参考文献 | 第59-67页 |
| 附录 | 第67-68页 |
