Tautomycetin合成基因ttnN的异源表达及功能研究
| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-10页 |
| 1 绪论 | 第10-36页 |
| ·天然活性物质的优势 | 第10页 |
| ·分子生物学对新活性物质开发的巨大推动作用 | 第10-11页 |
| ·聚酮化合物介绍 | 第11-17页 |
| ·活性地位 | 第11-12页 |
| ·结构特征 | 第12页 |
| ·结构分类 | 第12-13页 |
| ·合成途径 | 第13-17页 |
| ·前景展望 | 第17页 |
| ·Tautomycetin的研究 | 第17-30页 |
| ·理化特征 | 第17-19页 |
| ·历史概况 | 第19-21页 |
| ·活性机理 | 第21-24页 |
| ·细胞活性 | 第24-28页 |
| ·合成机制 | 第28-30页 |
| ·大肠杆菌中的可溶性异源蛋白表达 | 第30-32页 |
| ·蛋白异源表达的研究地位 | 第30-31页 |
| ·E.coli异源表达的优势 | 第31-32页 |
| ·E.coli异源表达的研究进展及待解问题 | 第32页 |
| ·Red重组策略简介 | 第32-33页 |
| ·立题依据 | 第33-36页 |
| ·TMC合成研究待解问题 | 第33-34页 |
| ·立题依据 | 第34-36页 |
| 2 目的基因的克隆及表达载体的构建 | 第36-52页 |
| ·引言 | 第36页 |
| ·材料及设备 | 第36-39页 |
| ·菌株及质粒 | 第36页 |
| ·主要试剂、试剂盒及工具酶 | 第36-37页 |
| ·主要仪器 | 第37-38页 |
| ·培养基制备 | 第38页 |
| ·主要溶液配制 | 第38-39页 |
| ·PCR引物 | 第39页 |
| ·实验方法 | 第39-43页 |
| ·SDS碱裂解法小规模制备质粒DNA | 第39-40页 |
| ·引物设计及PCR反应扩增 | 第40-41页 |
| ·质粒的双酶切 | 第41页 |
| ·线性DNA片段的回收 | 第41页 |
| ·目的片段的连接 | 第41-42页 |
| ·氯化钙法制备大肠杆菌感受态 | 第42页 |
| ·连接反应物的转化 | 第42页 |
| ·酶切鉴定转化子 | 第42-43页 |
| ·表达载体的宿主菌转化 | 第43页 |
| ·鉴定宿主菌中的转化子 | 第43页 |
| ·结果及讨论 | 第43-51页 |
| ·ttnN基因片段的纯化回收 | 第43-44页 |
| ·T克隆载体的构建 | 第44-45页 |
| ·表达载体的构建及鉴定 | 第45-51页 |
| ·小结 | 第51-52页 |
| 3 目的蛋白的诱导表达 | 第52-61页 |
| ·引言 | 第52页 |
| ·材料及设备 | 第52-54页 |
| ·主要试剂 | 第52-53页 |
| ·主要仪器及设备 | 第53页 |
| ·主要溶液 | 第53-54页 |
| ·发酵培养基 | 第54页 |
| ·实验方法 | 第54-57页 |
| ·目标蛋白的诱导表达 | 第54页 |
| ·取样时序及样品处理 | 第54-56页 |
| ·SDS-PAGE | 第56-57页 |
| ·结果与讨论 | 第57-60页 |
| ·诱导实验 | 第57页 |
| ·取样时序及样品处理讨论 | 第57-58页 |
| ·SDS-PAGE检测结果 | 第58-60页 |
| ·小结 | 第60-61页 |
| 4 ttnN的原位敲除及发酵验证 | 第61-69页 |
| ·引言 | 第61页 |
| ·材料设备 | 第61-62页 |
| ·器材 | 第61-62页 |
| ·培养基 | 第62页 |
| ·实验方法 | 第62-65页 |
| ·PCR扩增引物设计 | 第62-63页 |
| ·PCR扩增反应 | 第63页 |
| ·扩增片段纯化 | 第63页 |
| ·电转化感受细胞的制备 | 第63-64页 |
| ·电转及重组实验 | 第64页 |
| ·接合转移 | 第64-65页 |
| ·菌株的敲除鉴定 | 第65页 |
| ·发酵试验 | 第65页 |
| ·产物检测 | 第65页 |
| ·结果及讨论 | 第65-67页 |
| ·打靶柯斯质粒的构建 | 第65-66页 |
| ·接合转移结果及菌株敲除鉴定 | 第66-67页 |
| ·发酵验证及产物检测 | 第67页 |
| ·小结 | 第67-69页 |
| 结论 | 第69-70页 |
| 参考文献 | 第70-73页 |
| 附录A ttnN基因序列 | 第73-74页 |
| 附录B-1 pET32-a(+)质粒图谱示意图 | 第74-75页 |
| 附录B-2 pET32-a(+)质粒的表达区序列 | 第75-77页 |
| 附录C pQE-9质粒的图谱及表达区组成示意图 | 第77-78页 |
| 攻读硕士学位期间发表学术论文情况 | 第78-79页 |
| 致谢 | 第79-80页 |
