| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 第一章 绪论 | 第11-29页 |
| 1.1 1,5-戊二胺的概述 | 第11-12页 |
| 1.1.1 戊二胺的生物学功能 | 第12页 |
| 1.1.2 戊二胺的工业应用 | 第12页 |
| 1.2 戊二胺的生产方法 | 第12-23页 |
| 1.2.1 化学法合成戊二胺 | 第13页 |
| 1.2.2 戊二胺合成关键酶赖氨酸脱羧酶的研究进展 | 第13-16页 |
| 1.2.3 微生物发酵法合成戊二胺的研究进展 | 第16-20页 |
| 1.2.4 酶法合成戊二胺的研究进展 | 第20-21页 |
| 1.2.5 生物法戊二胺的产业化技术瓶颈 | 第21-23页 |
| 1.3 产酸克雷伯氏菌 | 第23-24页 |
| 1.4 微生物酶蛋白的分子改造策略 | 第24-27页 |
| 1.4.1 提高酶蛋白异源表达效率的策略 | 第24-25页 |
| 1.4.2 提高酶蛋白工业应用属性的策略 | 第25-27页 |
| 1.5 课题背景、意义和研究内容 | 第27-29页 |
| 1.5.1 课题的研究背景和意义 | 第27页 |
| 1.5.2 本论文的研究内容 | 第27-29页 |
| 第二章 基于密码子、启动子优化的K. oxytoca赖氨酸脱羧酶的异源表达研究 | 第29-45页 |
| 2.1 材料和方法 | 第29-34页 |
| 2.1.1 菌种与质粒 | 第29-30页 |
| 2.1.2 工具酶和主要试剂 | 第30页 |
| 2.1.3 主要仪器 | 第30-31页 |
| 2.1.4 培养基 | 第31页 |
| 2.1.5 产酸克雷伯氏菌赖氨酸脱羧基因克隆、异源表达 | 第31页 |
| 2.1.6 赖氨酸脱羧酶基因的密码子优化 | 第31页 |
| 2.1.7 赖氨酸脱羧酶基因的启动子优化 | 第31-32页 |
| 2.1.8 重组菌摇管发酵 | 第32页 |
| 2.1.9 重组菌 10 L罐分批发酵 | 第32-33页 |
| 2.1.10 赖氨酸脱羧酶酶的酶活力测定方法 | 第33-34页 |
| 2.1.11 赖氨酸脱羧酶的纯化及SDS-PAGE | 第34页 |
| 2.2 结果与讨论 | 第34-44页 |
| 2.2.1 产酸克雷伯氏菌赖氨酸脱羧酶基因ldc的扩增 | 第34-35页 |
| 2.2.2 重组载体p UC18-ldc的构建 | 第35页 |
| 2.2.3 产酸克雷伯氏菌赖氨酸脱羧酶在大肠杆菌的异源表达 | 第35-36页 |
| 2.2.4 赖氨酸脱羧酶的SDS-PAGE | 第36页 |
| 2.2.5 赖氨酸脱羧酶基因的密码子优化 | 第36-40页 |
| 2.2.6 摇管水平上，不同来源的赖氨酸脱羧酶合成戊二胺的能力对比 | 第40-41页 |
| 2.2.7 10L罐规模上，不同来源的赖氨酸脱羧酶活力对比 | 第41-42页 |
| 2.2.8 启动子优化提高赖氨酸脱羧酶的表达 | 第42-44页 |
| 2.3 本章小结 | 第44-45页 |
| 第三章K. oxytoca赖氨酸脱羧酶基因核糖体结合位点优化与酶蛋白分子定向进化 | 第45-59页 |
| 3.1 材料与方法 | 第45-50页 |
| 3.1.1 培养基 | 第45页 |
| 3.1.2 质粒、引物和菌株 | 第45-46页 |
| 3.1.3 主要试剂 | 第46页 |
| 3.1.4 主要仪器 | 第46页 |
| 3.1.5 96 孔板培养方法 | 第46-47页 |
| 3.1.6 摇管培养方法 | 第47页 |
| 3.1.7 戊二胺测定方法及L-赖氨酸到戊二胺转化率计算 | 第47页 |
| 3.1.8 赖氨酸脱羧酶纯化及SDS-PAGE电泳 | 第47页 |
| 3.1.9 高通量筛选方法 | 第47-48页 |
| 3.1.10 赖氨酸脱羧酶RBS序列优化 | 第48-49页 |
| 3.1.11 产酸克雷伯氏菌赖氨酸脱羧酶的分子定向进化 | 第49-50页 |
| 3.2 结果与讨论 | 第50-57页 |
| 3.2.1 菌株高通量筛选方法的确定 | 第50-51页 |
| 3.2.2 RBS序列优化及相关生物信息学统计分析 | 第51-52页 |
| 3.2.3 RBS突变株可溶性蛋白表达分析 | 第52-53页 |
| 3.2.4 赖氨酸脱羧酶的分子定向进化 | 第53-55页 |
| 3.2.5 赖氨酸脱羧酶突变位点与赖氨酸脱羧酶结构的生物信息学分析 | 第55-56页 |
| 3.2.6 分子定向进化的赖氨酸脱羧酶SDS-PAGE电泳分析 | 第56-57页 |
| 3.3 本章小结 | 第57-59页 |
| 第四章 产酸克雷伯氏菌赖氨酸脱羧酶的酶学特性研究 | 第59-67页 |
| 4.1 材料与方法 | 第59-61页 |
| 4.1.1 菌株 | 第59页 |
| 4.1.2 主要试剂 | 第59页 |
| 4.1.3 主要仪器 | 第59页 |
| 4.1.4 培养基及试管培养方法 | 第59页 |
| 4.1.5 细胞裂解方法 | 第59-60页 |
| 4.1.6 分子定向进化的赖氨酸脱羧酶酶液反应动力学参数的测定 | 第60页 |
| 4.1.7 赖氨酸脱羧酶蛋白纯化制备 | 第60页 |
| 4.1.8 野生型赖氨酸脱羧酶的最适p H和p H稳定性 | 第60页 |
| 4.1.9 野生型赖氨酸脱羧酶的最适温度和温度稳定性 | 第60-61页 |
| 4.1.10 不同金属离子对赖氨酸脱羧酶活的影响 | 第61页 |
| 4.1.11 分子定向进化的赖氨酸脱羧酶的p H稳定性 | 第61页 |
| 4.2 结果与讨论 | 第61-65页 |
| 4.2.1 分子定向进化的赖氨酸脱羧酶反应动力学参数的测定 | 第61-62页 |
| 4.2.2 野生型赖氨酸脱羧酶的最适反应p H和p H稳定性 | 第62-63页 |
| 4.2.3 野生型赖氨酸脱羧酶的最适反应温度和温度稳定性 | 第63-64页 |
| 4.2.4 不同金属离子对赖氨酸脱羧酶活性的影响 | 第64页 |
| 4.2.5 分子定向进化的赖氨酸脱羧酶的p H稳定性 | 第64-65页 |
| 4.3 本章小结 | 第65-67页 |
| 第五章E. coli LN3014发酵产赖氨酸脱羧酶过程特性 | 第67-75页 |
| 5.1 材料与方法 | 第67-68页 |
| 5.1.1 主要仪器 | 第67页 |
| 5.1.2 菌株 | 第67页 |
| 5.1.3 培养基 | 第67页 |
| 5.1.4 培养方法 | 第67-68页 |
| 5.1.5 发酵液赖氨酸脱羧酶活测定方法 | 第68页 |
| 5.1.6 L-赖氨酸和戊二胺含量测定方法 | 第68页 |
| 5.1.7 培养基正交试验设计 | 第68页 |
| 5.1.8 补料分批发酵 | 第68页 |
| 5.2 结果与讨论 | 第68-74页 |
| 5.2.1 起始葡萄糖浓度对重组菌发酵产酶的影响 | 第68-69页 |
| 5.2.2 主要氮源对重组菌发酵产酶的影响 | 第69-70页 |
| 5.2.3 辅助氮源对E. coli LN3014发酵产酶的影响 | 第70页 |
| 5.2.4 诱导物对E. coli LN3014发酵产酶的影响 | 第70-71页 |
| 5.2.5 不同辅酶添加量对发酵产酶的影响 | 第71-72页 |
| 5.2.6 重组菌摇瓶发酵产酶过程 | 第72页 |
| 5.2.7 摇瓶水平上发酵培养基的正交优化 | 第72-73页 |
| 5.2.8 E. coli LN3014在 10 L罐的分批发酵研究 | 第73页 |
| 5.2.9 重组菌E. coli LN3014在 10 L罐的补料分批发酵研究 | 第73-74页 |
| 5.3 本章小结 | 第74-75页 |
| 第六章 赖氨酸脱羧酶催化合成戊二胺的过程优化 | 第75-87页 |
| 6.1 材料与方法 | 第75-76页 |
| 6.1.1 菌株 | 第75页 |
| 6.1.2 主要试剂 | 第75页 |
| 6.1.3 不调节p H，细胞催化生成戊二胺的过程优化 | 第75页 |
| 6.1.4 固定化细胞研究 | 第75-76页 |
| 6.1.5 固定化细胞反应特性研究 | 第76页 |
| 6.2 结果与讨论 | 第76-84页 |
| 6.2.1 不调节反应体系p H，不同底物浓度对催化生成戊二胺的影响 | 第76-77页 |
| 6.2.2 不调节反应体系p H，不同细胞量对催化生成戊二胺的影响 | 第77页 |
| 6.2.3 辅酶添加量对赖氨酸脱羧的影响 | 第77-78页 |
| 6.2.4 海藻酸钠固定化细胞 | 第78-81页 |
| 6.2.5 聚乙烯醇固定化细胞 | 第81-82页 |
| 6.2.6 固定化细胞重复利用催化生成戊二胺 | 第82-83页 |
| 6.2.7 固定化细胞的特性研究 | 第83-84页 |
| 6.3 本章小结 | 第84-87页 |
| 主要结论与展望 | 第87-89页 |
| 主要结论 | 第87-88页 |
| 展望 | 第88-89页 |
| 论文创新点 | 第89-90页 |
| 致谢 | 第90-91页 |
| 参考文献 | 第91-96页 |
| 附录: 作者在攻读博士学位期间发表的论文 | 第96页 |
