| 致谢 | 第1-5页 |
| 摘要 | 第5-7页 |
| Abstract | 第7-9页 |
| 目录 | 第9-13页 |
| 第一章:文献综述 | 第13-36页 |
| ·植物次生代谢研究进展 | 第13-23页 |
| ·植物次生代谢产物的研究进展 | 第13-17页 |
| ·萜类化合物 | 第13-14页 |
| ·含氮类化合物 | 第14-15页 |
| ·酚类物质 | 第15页 |
| ·多糖类物质 | 第15-17页 |
| ·植物次生代谢途径及功能基因的研究概况 | 第17-23页 |
| ·萜类物质的代谢途径及相关基因的研究 | 第18-20页 |
| ·生物碱代谢途径及相关基因的研究概况 | 第20-22页 |
| ·苯丙烷类化合物的生物合成途径基相关基因的研究 | 第22-23页 |
| ·植物基因克隆研究进展 | 第23-32页 |
| ·功能克隆 | 第24页 |
| ·应用基因芯片技术筛选新基因 | 第24-25页 |
| ·图位克隆 | 第25-26页 |
| ·同源序列克隆技术 | 第26-30页 |
| ·差异表达基因的分离技术 | 第30-31页 |
| ·表达序列标签技术 | 第31页 |
| ·转座子和T-DNA标签技术 | 第31-32页 |
| ·植物托品烷生物碱研究进展 | 第32-35页 |
| ·托品烷生物碱概述 | 第32页 |
| ·托品烷生物碱代谢途径研究概况 | 第32-35页 |
| ·本研究内容及意义 | 第35-36页 |
| 第二章 实验材料与方法 | 第36-49页 |
| ·实验材料 | 第36页 |
| ·金钗石斛托品酮还原酶同源基因的克隆 | 第36-41页 |
| ·金钗石斛组培苗的获得 | 第36页 |
| ·实验材料 | 第36页 |
| ·实验试剂和仪器 | 第36页 |
| ·培养基及其培养条件 | 第36页 |
| ·金钗石斛组培苗总RNA的提取 | 第36-37页 |
| ·RNA提取前的准备工作 | 第36-37页 |
| ·热酚法大量提取金钗石斛总RNA | 第37页 |
| ·总RNA质量的检测 | 第37-38页 |
| ·金钗石斛托品酮还原酶同源基因的克隆 | 第38页 |
| ·PCR产物的纯化回收 | 第38-39页 |
| ·目的片段与T-载体的连接 | 第39页 |
| ·大肠感菌感受态的制备 | 第39-40页 |
| ·重组质粒的转化和筛选 | 第40页 |
| ·重组质粒的提取 | 第40-41页 |
| ·重组质粒的PCR鉴定及序列测定 | 第41页 |
| ·基因表达的qPCR分析 | 第41-42页 |
| ·组织特异性表达分析 | 第41-42页 |
| ·不同信号分子诱导下基因表达分析 | 第42页 |
| ·原核表达及重组蛋白的酶活分析 | 第42-49页 |
| ·基因原核表达载体的构建 | 第42-45页 |
| ·引物设计 | 第42-43页 |
| ·重组质粒的双酶切 | 第43页 |
| ·DNA片段回收 | 第43页 |
| ·DNA片段回收产物与PET28a连接 | 第43页 |
| ·重组表达载体质粒的提取 | 第43页 |
| ·PCR与测序验证 | 第43-44页 |
| ·重组表达载体质粒转化表达菌BL21 | 第44页 |
| ·菌液PCR验证与测序验证 | 第44-45页 |
| ·基因在大肠杆菌中的诱导表达 | 第45页 |
| ·不同单克隆的IPTG诱导表达 | 第45页 |
| ·不同IPTG浓度诱导表达 | 第45页 |
| ·Western Blot检测 | 第45-46页 |
| ·诱导蛋白的纯化 | 第46-48页 |
| ·蛋白诱导表达 | 第46页 |
| ·透析袋的预处理 | 第46页 |
| ·粗酶液的制取 | 第46-47页 |
| ·蛋白纯化及后续处理 | 第47页 |
| ·Ni Sepharose 6 Fast Flow再生 | 第47页 |
| ·Bradford法蛋白浓度检测标准曲线的制作 | 第47-48页 |
| ·酶活性检测 | 第48-49页 |
| 第三章 结果与讨论 | 第49-78页 |
| ·总RNA的提取 | 第49页 |
| ·金钗石斛托品酮还原酶同源基因Ⅰ和ⅡcDNA的克隆及生物信息学分析 | 第49-59页 |
| ·金钗石斛托品酮还原酶同源基因Ⅰ和Ⅱ的克隆 | 第49-52页 |
| ·金钗石斛托品酮还原酶同源基因Ⅰ和Ⅱ生物信息学分析 | 第52-59页 |
| ·DnTRⅠ和DnTRⅡ蛋白的理化性质分析 | 第52-53页 |
| ·DNTRⅠ和DNTRⅡ蛋白信号肽预测 | 第53-54页 |
| ·DnTRⅠ和DnTRⅡ蛋白的高级结构预测 | 第54-56页 |
| ·DnTRⅠ和DnTRⅡ蛋白同源性比较 | 第56-59页 |
| ·金钗石斛托品酮还原酶同源基因Ⅰ和Ⅱ基因表达的qPCR分析 | 第59-64页 |
| ·组织特异性分析 | 第59-61页 |
| ·根茎叶RNA的提取 | 第59-60页 |
| ·基因组织特异性表达分析 | 第60-61页 |
| ·信号分子处理对DnTRⅠ和DnTRⅡ基因表达水平的影响 | 第61-64页 |
| ·DnTRⅠ和DnTRⅡ茉莉酸甲酯诱导下的表达模式 | 第61-62页 |
| ·DnTRⅠ和DnTRⅡSNP诱导下的表达模式 | 第62-63页 |
| ·DnTRⅠ和DnTRⅡSA诱导下的表达模式 | 第63-64页 |
| ·金钗石斛托品酮还原酶同源基因Ⅰ和Ⅱ原核表达分析及酶活分析 | 第64-74页 |
| ·原核表达载体的构建 | 第64-69页 |
| ·金钗石斛托品酮还原酶同源基因Ⅰ和Ⅱ与克隆载体的连接 | 第66-67页 |
| ·双酶切片段与原核表达载体pET28a(+)的连接 | 第67-69页 |
| ·蛋白诱导表达分析 | 第69-72页 |
| ·不同单斑的IPTG诱导表达 | 第70页 |
| ·不同IPTG浓度诱导 | 第70-72页 |
| ·Western Blot | 第72页 |
| ·蛋白纯化及酶活测定 | 第72-74页 |
| ·Bradford法蛋白浓度测定标准曲线 | 第72页 |
| ·DnTRⅠ和DnTRⅡ蛋白纯化 | 第72-73页 |
| ·DnTRⅠ和DnTRⅡ蛋白酶活测定 | 第73-74页 |
| ·讨论 | 第74-78页 |
| 第四章 实验结论与展望 | 第78-80页 |
| ·实验结论 | 第78页 |
| ·试验展望 | 第78-80页 |
| 参考文献 | 第80-84页 |
| 附录 | 第84-88页 |
