| 摘要 | 第5-6页 |
| abstract | 第6-7页 |
| 第1章 绪论 | 第12-18页 |
| 1.1 酿酒酵母的概述 | 第12页 |
| 1.2 酿酒酵母衰老机制的研究 | 第12-14页 |
| 1.2.1 复制寿命的研究 | 第12-13页 |
| 1.2.2 时序寿命的研究 | 第13-14页 |
| 1.3 CRISPR系统 | 第14-17页 |
| 1.3.1 CRISPR系统的研究历史 | 第14-15页 |
| 1.3.2 CRISPR/Cas系统的组成结构及分类 | 第15页 |
| 1.3.3 CRISPR/Cas系统的作用机制 | 第15-16页 |
| 1.3.4 CRISPR/Cas9系统的应用 | 第16-17页 |
| 1.4 本研究的意义 | 第17-18页 |
| 第2章 建立CRISPR系统在酿酒酵母中基因插入的方法 | 第18-35页 |
| 2.1 实验材料 | 第18-21页 |
| 2.1.1 菌株及质粒 | 第18页 |
| 2.1.2 培养基 | 第18页 |
| 2.1.3 实验试剂 | 第18-20页 |
| 2.1.4 实验主要仪器 | 第20页 |
| 2.1.5 引物名称及序列 | 第20-21页 |
| 2.2 实验方法 | 第21-30页 |
| 2.2.1 CRISPR/Cas9系统在酵母基因组上插入的技术路线 | 第22页 |
| 2.2.2 分析酿酒酵母TEP1基因序列 | 第22-23页 |
| 2.2.3 设计TEP1基因序列gRNA | 第23-24页 |
| 2.2.4 构建用于基因插入的gRNA/Cas9共表达质粒 | 第24页 |
| 2.2.5 pCRCTG-I质粒的构建 | 第24-27页 |
| 2.2.6 pCRCTG-IIa质粒的构建 | 第27页 |
| 2.2.7 pCRCTG-IIb质粒的构建 | 第27-28页 |
| 2.2.8 pCRCTG-I,pCRCTG-IIa,pCRCTG-IIb质粒分别转化酿酒酵母JM菌株 | 第28-29页 |
| 2.2.9 转化子的验证 | 第29页 |
| 2.2.10 重组体的筛选 | 第29-30页 |
| 2.2.11 测序验证重组体 | 第30页 |
| 2.3 实验结果与分析 | 第30-33页 |
| 2.3.1 pCRCTG-I,pCRCTG-IIa,pCRCTG-IIb质粒的正确构建 | 第30页 |
| 2.3.2 阳性转化子的获得 | 第30-31页 |
| 2.3.3 重组体的获得 | 第31-33页 |
| 2.4 本章小结 | 第33-35页 |
| 第3章 强化POS5基因,同时突变LOS1、TEP1、GRC5、ISW2、SWI1基因 | 第35-52页 |
| 3.1 实验材料 | 第35-36页 |
| 3.1.1 菌株及质粒 | 第35页 |
| 3.1.2 培养基 | 第35-36页 |
| 3.1.3 实验试剂 | 第36页 |
| 3.1.4 实验主要仪器 | 第36页 |
| 3.2 实验方法 | 第36-44页 |
| 3.2.1 本章节实验的技术路线 | 第38-40页 |
| 3.2.2 构建LOS1-POS5基因的gRNA/Cas9共表达质粒 | 第40-41页 |
| 3.2.3 构建TEP1、GRC5、ISW2、SWI1基因gRNA/Cas9共表达质粒 | 第41-42页 |
| 3.2.4 连接产物转化、质粒提取 | 第42页 |
| 3.2.5 重组质粒转化酿酒酵母M2- | 第42页 |
| 3.2.6 转化子的验证 | 第42页 |
| 3.2.7 突变体筛选 | 第42页 |
| 3.2.8 电击法去除突变株细胞中的质粒 | 第42-43页 |
| 3.2.9 以酿酒酵母M2-3菌株为出发菌对LOS1、POS5、TEP1,GRC5、ISW2、 | 第43页 |
| SWI1基因进行叠加编辑 | 第43-44页 |
| 3.3 实验结果与分析 | 第44-51页 |
| 3.3.1 LOS1和POS5基因的gRNA/Cas9共表达质粒的正确构建 | 第44页 |
| 3.3.2 测序验证LOS1-POS5基因的gRNA/Cas9共表达质粒的正确构建 | 第44-45页 |
| 3.3.3 TEP1、GRC5、ISW2、SWI1基因的gRNA/Cas9共表达质粒的正确构建 | 第45页 |
| 3.3.4 测序验证TEP1、GRC5、ISW2、SWI1基因的gRNA/Cas9共表达质粒的正确构建 | 第45-46页 |
| 3.3.5 阳性转化子的获得 | 第46页 |
| 3.3.6 突变体的获得 | 第46-47页 |
| 3.3.7 电击法去除突变株细胞中的质粒 | 第47-48页 |
| 3.3.8 叠加编辑突变体M2-3-V的获得 | 第48-51页 |
| 3.4 本章小结 | 第51-52页 |
| 第4章 定点突变酿酒酵母YPT1基因 | 第52-64页 |
| 4.1 实验材料 | 第52页 |
| 4.1.1 菌株及质粒 | 第52页 |
| 4.1.2 培养基 | 第52页 |
| 4.1.3 实验试剂 | 第52页 |
| 4.1.4 实验主要仪器 | 第52页 |
| 4.2 实验方法 | 第52-58页 |
| 4.2.1 实验技术路线 | 第53页 |
| 4.2.2 设计YPT1基因序列的突变位点 | 第53-54页 |
| 4.2.3 分别扩增同源臂,突变序列,筛选标记基因序列 | 第54-55页 |
| 4.2.4 LigationMix连接酶连接 | 第55-56页 |
| 4.2.5 连接产物转化、质粒提取 | 第56页 |
| 4.2.6 拼接的片段电击转化酿酒酵母M2-3-V | 第56页 |
| 4.2.7 重组体的验证 | 第56-57页 |
| 4.2.8 突变株进行代谢活性测定 | 第57-58页 |
| 4.3 实验结果与分析 | 第58-62页 |
| 4.3.1 PCR扩增同源臂序列、突变序列和筛选标记序列 | 第58-59页 |
| 4.3.2 序列拼接 | 第59-60页 |
| 4.3.3 重组体的获得 | 第60-61页 |
| 4.3.4 突变株生长曲线的测定 | 第61页 |
| 4.3.5 突变株时序寿命的测定 | 第61-62页 |
| 4.3.6 突变株复制寿命的测定 | 第62页 |
| 4.4 本章小结 | 第62-64页 |
| 第5章 结论 | 第64-65页 |
| 参考文献 | 第65-68页 |
| 致谢 | 第68-69页 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 | 第69页 |
