| 符号说明 | 第5-11页 |
| 中文摘要 | 第11-13页 |
| 英文摘要 | 第13-15页 |
| 1 前言 | 第16-26页 |
| 1.1 一族LEA蛋白(D-19) | 第18-19页 |
| 1.2 二族LEA蛋白(D-11) | 第19-22页 |
| 1.3 三族LEA蛋白(D-7/D-29) | 第22-23页 |
| 1.4 四族LEA蛋白 | 第23页 |
| 1.5 五族LEA蛋白 | 第23-24页 |
| 1.6 六族LEA蛋白(PVLEA18) | 第24页 |
| 1.7 七族LEA蛋白(ASR1) | 第24-25页 |
| 1.8 本研究的目的及意义 | 第25-26页 |
| 2 材料和方法 | 第26-44页 |
| 2.1 实验材料 | 第26页 |
| 2.1.1 植物材料 | 第26页 |
| 2.1.2 菌株与质粒 | 第26页 |
| 2.1.3 酶及生化试剂 | 第26页 |
| 2.2 实验方法 | 第26-44页 |
| 2.2.1 植物材料总RNA的提取 | 第26-27页 |
| 2.2.2 反转录cDNA第一链的合成 | 第27-28页 |
| 2.2.3 PCR扩增 | 第28页 |
| 2.2.4 DNA纯化回收 | 第28-29页 |
| 2.2.5 制备大肠杆菌感受态细胞 | 第29页 |
| 2.2.6 目的片段连接克隆载体 | 第29页 |
| 2.2.7 转化大肠杆菌感受态细胞 | 第29-30页 |
| 2.2.8 质粒DNA的提取 | 第30页 |
| 2.2.9 植物基因组的提取 | 第30-31页 |
| 2.2.10 Southern杂交分析 | 第31-33页 |
| 2.2.11 Northern杂交分析 | 第33-34页 |
| 2.2.12 农杆菌感受态制备和转化 | 第34页 |
| 2.2.13 农杆菌介导转化烟草 | 第34-35页 |
| 2.2.14 转基因烟草的鉴定 | 第35页 |
| 2.2.15 亚细胞定位 | 第35-36页 |
| 2.2.16 蛋白的表达及纯化 | 第36-37页 |
| 2.2.17 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) | 第37-38页 |
| 2.2.18 植物蛋白的提取 | 第38页 |
| 2.2.19 Western blot检测蛋白表达 | 第38-39页 |
| 2.2.20 金属免疫亲和色谱(IMAC) | 第39页 |
| 2.2.21 酵母表达载体的构建 | 第39页 |
| 2.2.22 转化酵母 | 第39-40页 |
| 2.2.23 激酶实验 | 第40-41页 |
| 2.2.24 乳酸脱氢酶活性的检测 | 第41页 |
| 2.2.25 扩得缺失各保守结构域的突变蛋白 | 第41页 |
| 2.2.26 MDA含量的测定 | 第41-42页 |
| 2.2.27 相对电导率的测定 | 第42页 |
| 2.2.28 氧自由基含量的测定 | 第42页 |
| 2.2.29 相对含水量的测定 | 第42页 |
| 2.2.30 叶绿素含量的测定 | 第42-43页 |
| 2.2.31 核酸酶活性的测定 | 第43页 |
| 2.2.32 凝胶迁移实验 | 第43页 |
| 2.2.33 NBT和台盼蓝染色 | 第43页 |
| 2.2.34 基因启动子顺式作用元件预测 | 第43页 |
| 2.2.35 蛋白序列的生物信息学分析 | 第43-44页 |
| 3 结果与分析 | 第44-85页 |
| 3.1 玉米基因组LEA蛋白的鉴定 | 第44-46页 |
| 3.2 玉米二族LEA蛋白基因ZmDHN13的分离及功能分析 | 第46-62页 |
| 3.2.0 ZmDHN13基因的分离 | 第46页 |
| 3.2.1 ZmDHN13蛋白分析 | 第46-48页 |
| 3.2.2 ZmDHN13基因表达分析 | 第48-49页 |
| 3.2.3 ZmDHN13基因启动子的克隆及分析 | 第49-51页 |
| 3.2.4 ZmDHN13基因拷贝数的分析 | 第51-52页 |
| 3.2.5 获得缺失保守结构域的ZmDHN13突变基因 | 第52页 |
| 3.2.6 ZmDHN13的亚细胞定位 | 第52-54页 |
| 3.2.7 磷酸化实验 | 第54页 |
| 3.2.8 金属亲和免疫色谱 | 第54-55页 |
| 3.2.9 ZmDHN13保护LDH的活性依赖于K结构域 | 第55页 |
| 3.2.10 ZmDHN13与DNA间的关系 | 第55-57页 |
| 3.2.11 过表达ZmDHN13提高转基因烟草对铜离子胁迫抗性 | 第57-58页 |
| 3.2.12 过表达ZmDHN13提高转基因烟草对氧化胁迫的抗性 | 第58-59页 |
| 3.2.13 拟南芥KS型脱水素AtHIRD11参与信号途径的分析 | 第59-62页 |
| 3.3 玉米三族LEA蛋白基因ZmLEA3的分离及功能分析 | 第62-74页 |
| 3.3.1 ZmLEA3基因的克隆及分析 | 第62-64页 |
| 3.3.2 ZmLEA3基因的表达分析 | 第64-66页 |
| 3.3.3 ZmLEA3蛋白的纯化 | 第66-67页 |
| 3.3.4 ZmLEA3与金属离子结合能力的分析 | 第67-68页 |
| 3.3.5 ZmLEA3蛋白的亚细胞定位 | 第68页 |
| 3.3.6 ZmLEA3转基因烟草的分析 | 第68-69页 |
| 3.3.7 过表达ZmLEA3提高转基因烟草对水分胁迫的抗性 | 第69-70页 |
| 3.3.8 过表达ZmLEA3提高转基因烟草对氧化胁迫的抗性 | 第70-71页 |
| 3.3.9 过表达ZmLEA3提高转基因酵母对水分胁迫和氧化胁迫的抗性 | 第71-72页 |
| 3.3.10 ZmLEA3保护LDH的活性免受水分胁迫和氧化胁迫的影响 | 第72页 |
| 3.3.11 过表达ZmLEA3影响转基因烟草对生物胁迫的响应 | 第72-74页 |
| 3.4 玉米五族LEA蛋白基因ZmLE5C的分离及功能分析 | 第74-80页 |
| 3.4.1 ZmLEA5C基因的分离和生物信息学分析 | 第74页 |
| 3.4.2 ZmLEA5C基因的表达分析 | 第74-76页 |
| 3.4.3 ZmLEA5C的亚细胞定位 | 第76-77页 |
| 3.4.4 ZmLEA5C的磷酸化分析 | 第77页 |
| 3.4.5 ZmLEA5C保护LDH的活性免受水分胁迫和低温的影响 | 第77-78页 |
| 3.4.6 过表达ZmLEA5C提高转基因酵母对渗透胁迫和低温胁迫的抗性 | 第78页 |
| 3.4.7 过表达ZmLEA5C-GFP融合蛋白提高转基因烟草对低温胁迫的抗性 | 第78-80页 |
| 3.4.8 过表达ZmLEA5C-GFP融合蛋白提高转基因烟草对渗透胁迫的抗性 | 第80页 |
| 3.5 烟草响应Pst DC3000主要依赖SA信号途径 | 第80-85页 |
| 3.5.1 病害相关基因对SA和JA的不同响应 | 第81页 |
| 3.5.2 病害相关基因对Pst DC3000的响应 | 第81-82页 |
| 3.5.3 SA诱导的超敏反应并不完全依赖于ROS的积累 | 第82-83页 |
| 3.5.4 JA负调烟草响应Pst DC3000导致的HR发生和SA的积累 | 第83-85页 |
| 4 讨论 | 第85-90页 |
| 4.1 KS型脱水素ZmDHN13的作用机制 | 第85-87页 |
| 4.1.1 ZmDHN13基因组成型表达并且受各种非生物胁迫的诱导 | 第85页 |
| 4.1.2 ZmDHN13的磷酸化和核定位依赖于S结构域和NLS结构域 | 第85-86页 |
| 4.1.3 ZmDHN13具有核酸酶的活性 | 第86页 |
| 4.1.4 过表达ZmDHN13提高转基因植株对氧化胁迫和重金属胁迫的抗性 | 第86-87页 |
| 4.1.5 KS型脱水素的作用机制 | 第87页 |
| 4.2 玉米三族LEA蛋白ZmLEA3的作用机制 | 第87-88页 |
| 4.2.1 ZmLEA3参与非生物胁迫 | 第87-88页 |
| 4.2.2 ZmLEA3参与生物胁迫 | 第88页 |
| 4.3 ZmLEA5C提高转基因烟草对低温胁迫和渗透胁迫的抗性 | 第88页 |
| 4.4 不同家族LEA蛋白间的功能和作用机制存在异同点 | 第88-89页 |
| 4.5 烟草响应Pst DC3000主要依赖于SA信号途径 | 第89-90页 |
| 5 结论 | 第90-91页 |
| 参考文献 | 第91-106页 |
| 致谢 | 第106-107页 |
| 攻读学位期间发表论文情况 | 第107页 |
