| 摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-8页 |
| 第一章 前言 | 第14-29页 |
| 1.1 氨基酸脱羧酶 | 第14页 |
| 1.2 生物胺 | 第14-16页 |
| 1.2.1 生物胺的生理作用 | 第15-16页 |
| 1.2.2 生物胺的毒性 | 第16页 |
| 1.3 组胺与组氨酸脱羧酶 | 第16-17页 |
| 1.4 组胺的形成机制及代谢途径 | 第17-25页 |
| 1.4.1 产组胺的微生物 | 第18-22页 |
| 1.4.1.1 微生物学法 | 第18-19页 |
| 1.4.1.2 分子生物学法 | 第19-20页 |
| 1.4.1.3 化学法 | 第20-21页 |
| 1.4.1.4 其它检测生物胺的方法 | 第21-22页 |
| 1.4.2 组氨酸脱羧酶 | 第22-25页 |
| 1.4.2.1 组氨酸脱羧酶蛋白结构及基因调控机制 | 第22-24页 |
| 1.4.2.2 影响组氨酸脱羧酶活性的因素 | 第24页 |
| 1.4.2.3 氨基酸和氨基酸/胺转运蛋白 | 第24-25页 |
| 1.4.3 生物胺的代谢途径 | 第25页 |
| 1.5 组胺的控制与消除 | 第25-26页 |
| 1.5.1 使用无氨基酸脱羧酶活性的生产菌株 | 第25-26页 |
| 1.5.2 生物胺降解酶 | 第26页 |
| 1.5.2.1 胺氧化酶(Amine oxidase) | 第26页 |
| 1.5.2.2 胺脱氢酶(Amine dehydrogenases) | 第26页 |
| 1.6 课题研究目的和意义 | 第26-28页 |
| 1.7 技术路线 | 第28-29页 |
| 第二章 材料与方法 | 第29-51页 |
| 2.1 实验材料 | 第29-34页 |
| 2.1.1 样品来源 | 第29页 |
| 2.1.2 菌株和质粒 | 第29-30页 |
| 2.1.3 菌株保存 | 第30页 |
| 2.1.4 抗生素 | 第30页 |
| 2.1.5 常用药品与酶制剂 | 第30-31页 |
| 2.1.6 主要仪器及设备 | 第31页 |
| 2.1.7 实验试剂的配制 | 第31-34页 |
| 2.1.7.1 常用培养基 | 第32页 |
| 2.1.7.2 常用溶液 | 第32-34页 |
| 2.2 实验方法 | 第34-51页 |
| 2.2.1 微生物法筛选分离产组氨酸脱羧酶菌株 | 第34页 |
| 2.2.2 分子生物学法鉴定产组氨酸脱羧酶菌株 | 第34-36页 |
| 2.2.2.1 细菌基因组的提取 | 第34-35页 |
| 2.2.2.2 hdc基因验证引物的选择 | 第35页 |
| 2.2.2.3 PCR法检测hdc基因 | 第35-36页 |
| 2.2.3 化学法检验产组胺菌合成组胺的能力 | 第36页 |
| 2.2.4 产组胺微生物的生理生化鉴定 | 第36页 |
| 2.2.5 产组胺微生物16S rDNA鉴定 | 第36-37页 |
| 2.2.6 细菌生长曲线和pH值变化 | 第37页 |
| 2.2.7 质粒DNA提取 | 第37-38页 |
| 2.2.8 琼脂糖凝胶电泳 | 第38页 |
| 2.2.9 PCR产物纯化 | 第38-39页 |
| 2.2.10 DNA酶切与连接 | 第39-40页 |
| 2.2.10.1 DNA双酶切 | 第39页 |
| 2.2.10.2 DNA的连接 | 第39-40页 |
| 2.2.11 质粒DNA(连接产物)的转化 | 第40-41页 |
| 2.2.11.1 E.coli感受态细胞制备(电转化法) | 第40页 |
| 2.2.11.2 外源DNA的电转化 | 第40-41页 |
| 2.2.12 hdc1基因在大肠杆菌中表达与蛋白检测及生物信息学分析 | 第41-44页 |
| 2.2.12.1 PCR扩增目的基因片段 | 第41-42页 |
| 2.2.12.2 表达重组质粒的构建 | 第42页 |
| 2.2.12.3 hdc1基因的生物信息学分析 | 第42-43页 |
| 2.2.12.4 目的蛋白的诱导表达与纯化 | 第43-44页 |
| 2.2.13 SDS-PAGE配制及电泳 | 第44-45页 |
| 2.2.14 组氨酸脱羧酶产生菌粗酶液的制备 | 第45页 |
| 2.2.14.1 菌体培养收集 | 第45页 |
| 2.2.14.2 酶液的制备 | 第45页 |
| 2.2.15 蛋白浓度测定 | 第45-46页 |
| 2.2.16 组氨酸脱羧酶酶学性质的测定 | 第46-51页 |
| 2.2.16.1 酶活测定原理 | 第46页 |
| 2.2.16.2 组胺标准曲线的制作 | 第46-48页 |
| 2.2.16.3 组氨酸脱羧酶酶活测定 | 第48-49页 |
| 2.2.16.4 组氨酸脱羧酶最适温度的测定 | 第49页 |
| 2.2.16.5 组氨酸脱羧酶最适pH的测定 | 第49页 |
| 2.2.16.6 组氨酸脱羧酶的热稳定性 | 第49页 |
| 2.2.16.7 组氨酸脱羧酶的pH稳定性 | 第49页 |
| 2.2.16.8 金属离子对组氨酸脱羧酶酶活的影响 | 第49-50页 |
| 2.2.16.9 化学试剂和EDTA对组氨酸脱羧酶酶活的影响 | 第50页 |
| 2.2.16.10 组氨酸脱羧酶的动力学参数测定 | 第50-51页 |
| 第三章 结果与讨论 | 第51-78页 |
| 3.1 组氨酸脱羧酶活性菌株的鉴定 | 第51-58页 |
| 3.1.1 微生物法筛选分离组氨酸脱羧酶产生菌 | 第51-52页 |
| 3.1.2 分子生物学法鉴定组氨酸脱羧酶产生菌 | 第52-54页 |
| 3.1.2.1 基因组的提取 | 第52-53页 |
| 3.1.2.2 组氨酸脱羧酶的PCR扩增结果 | 第53-54页 |
| 3.1.3 化学法检验组胺的合成量 | 第54页 |
| 3.1.4 产组胺微生物的生理生化鉴定 | 第54-55页 |
| 3.1.5 产组胺微生物16S rDNA鉴定 | 第55-57页 |
| 3.1.6 细菌生长曲线和pH值变化 | 第57-58页 |
| 3.2 组氨酸脱羧酶基因的克隆 | 第58-59页 |
| 3.2.1 PCR扩增hdc1基因 | 第58页 |
| 3.2.2 hdc1基因重组质粒的构建 | 第58-59页 |
| 3.3 hdc1基因的生物信息学分析 | 第59-66页 |
| 3.3.1 pET-30a(+)/hdc1测序结果分析 | 第59-61页 |
| 3.3.2 多重序列比对 | 第61-63页 |
| 3.3.3 进化树的构建 | 第63页 |
| 3.3.4 Hdc1蛋白亲疏水性分析 | 第63-64页 |
| 3.3.5 Hdc1跨膜结构预测 | 第64-65页 |
| 3.3.6 Hdc1的功能结构域预测 | 第65页 |
| 3.3.7 Hdc1的活性位点预测 | 第65-66页 |
| 3.3.8 Hdc1蛋白的二级结构预测 | 第66页 |
| 3.4 hdc1基因的诱导表达与纯化 | 第66-67页 |
| 3.5 HDC及Hdc1重组蛋白的酶学性质研究 | 第67-78页 |
| 3.5.1 最适温度的测定 | 第67-68页 |
| 3.5.2 最适pH的测定 | 第68-70页 |
| 3.5.3 酶热稳定性的测定 | 第70-71页 |
| 3.5.4 酶pH稳定性的测定 | 第71-72页 |
| 3.5.5 金属离子对酶活的影响 | 第72-73页 |
| 3.5.6 化学试剂对酶活的影响 | 第73-75页 |
| 3.5.7 酶的动力学参数测定 | 第75-78页 |
| 第四章 讨论 | 第78-84页 |
| 4.1 产组胺微生物的鉴定 | 第78-79页 |
| 4.2 Hdc1重组蛋白的表达 | 第79-80页 |
| 4.3 酶学性质 | 第80-81页 |
| 4.4 酶的底物谱与活性功能位点 | 第81-84页 |
| 第五章 总结与展望 | 第84-86页 |
| 5.1 结论 | 第84-85页 |
| 5.2 展望 | 第85-86页 |
| 参考文献 | 第86-97页 |
| 致谢 | 第97-98页 |
| 硕士阶段发表论文情况 | 第98-99页 |
| 附录 | 第99-100页 |
