| 致谢 | 第5-6页 |
| 摘要 | 第6-8页 |
| ABSTRACT | 第8-10页 |
| 主要缩略符号说明 | 第16-18页 |
| 第一章 绪论 | 第18-42页 |
| 1.1 引言 | 第18页 |
| 1.2 L-(+)-酒石酸概述 | 第18-20页 |
| 1.2.1 L-(+)-酒石酸的理化性质 | 第18-19页 |
| 1.2.2 L-(+)-酒石酸的用途 | 第19-20页 |
| 1.3 L-(+)-酒石酸生产概况 | 第20-22页 |
| 1.4 生物合成5-KGA的研究概况 | 第22-35页 |
| 1.4.1 氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans) | 第22-23页 |
| 1.4.2 葡萄糖的代谢及其相关基因 | 第23-25页 |
| 1.4.3 吡咯喹啉醌(Pyrroloquinoline quinine,PQQ) | 第25-28页 |
| 1.4.4 呼吸链电子传递系统 | 第28-31页 |
| 1.4.5 代谢工程技术在5-KGA生物合成中的应用 | 第31-33页 |
| 1.4.6 过程控制技术在5-KGA生物合成中的应用 | 第33-35页 |
| 1.5 糖质发酵生物制备L-(+)-酒石酸途径及机理 | 第35-36页 |
| 1.6 L-(+)-酒石酸的催化转化 | 第36-38页 |
| 1.7 论文研究意义和立题思想 | 第38-40页 |
| 1.8 论文主要研究内容 | 第40-42页 |
| 第二章 实验材料与方法 | 第42-50页 |
| 2.1 菌株与质粒 | 第42页 |
| 2.2 仪器与试剂 | 第42-43页 |
| 2.2.1 主要仪器 | 第42页 |
| 2.2.2 工具酶及主要试剂 | 第42-43页 |
| 2.3 培养基和培养条件 | 第43页 |
| 2.3.1 培养基组成 | 第43页 |
| 2.3.2 抗生素用量 | 第43页 |
| 2.4 分子生物学相关方法 | 第43-45页 |
| 2.4.1 基因组的提取 | 第43-44页 |
| 2.4.2 质粒的提取 | 第44页 |
| 2.4.3 PCR扩增目的基留 | 第44页 |
| 2.4.4 PCR产物回收及凝胶回收纯化DNA | 第44页 |
| 2.4.5 目的基因的酶切及连接 | 第44页 |
| 2.4.6 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 | 第44页 |
| 2.4.7 氧化葡萄糖酸杆菌感受态细胞的制备及转化 | 第44页 |
| 2.4.8 细胞的保存 | 第44-45页 |
| 2.4.9 菌落PCR快速检测 | 第45页 |
| 2.5 生物化学检测方法 | 第45-47页 |
| 2.5.1 pH的测定 | 第45页 |
| 2.5.2 细胞密度的测定 | 第45页 |
| 2.5.3 蛋白浓度测定 | 第45页 |
| 2.5.4 SDS-PAGE凝胶电泳 | 第45页 |
| 2.5.5 氧化葡萄糖酸杆菌膜组分的制备 | 第45-46页 |
| 2.5.6 酶活测定 | 第46页 |
| 2.5.7 H~+/O比及呼吸链末端醌醇氧化酶活力测定 | 第46页 |
| 2.5.8 PQQ浓度的测定 | 第46-47页 |
| 2.6 仪器分析方法 | 第47-50页 |
| 2.6.1 葡萄糖浓度的测定 | 第47页 |
| 2.6.2 代谢产物的高效液相检测 | 第47-49页 |
| 2.6.3 乙酸的气相色谱检测 | 第49-50页 |
| 第三章 产5-KGA工程菌的代谢途径优化 | 第50-70页 |
| 3.1 引言 | 第50-52页 |
| 3.2 材料和方法 | 第52-60页 |
| 3.2.1 菌株和质粒 | 第52页 |
| 3.2.2 主要工具酶 | 第52-53页 |
| 3.2.3 质粒DNA的提取及转化 | 第53页 |
| 3.2.4 DNA片段的酶切与连接 | 第53页 |
| 3.2.5 DNA片段的合成与测定 | 第53页 |
| 3.2.6 菌落PCR验证 | 第53页 |
| 3.2.7 自杀质粒pJKM的构建 | 第53-55页 |
| 3.2.8 敲除质粒的构建 | 第55-57页 |
| 3.2.9 GOX1231和GOX081的无痕敲除 | 第57-59页 |
| 3.2.10 产5-KGA重组菌的培养条件 | 第59页 |
| 3.2.11 动力学参数分析 | 第59-60页 |
| 3.2.12 重组菌的扩大培养 | 第60页 |
| 3.2.13 分析检测方法 | 第60页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第60-67页 |
| 3.3.1 不同初始葡萄糖浓度对G.oxydans ZJU1的影响 | 第60-62页 |
| 3.3.2 摇瓶发酵 | 第62-63页 |
| 3.3.3 动力学参数分析 | 第63-66页 |
| 3.3.4 分阶段溶氧控制5-KGA生物合成 | 第66-67页 |
| 3.4 小结 | 第67-70页 |
| 第四章 5-KGA生物合成途径关键酶的挖掘 | 第70-86页 |
| 4.1 引言 | 第70-72页 |
| 4.2 材料与方法 | 第72-76页 |
| 4.2.1 菌株和质粒 | 第72-73页 |
| 4.2.2 主要工具酶 | 第73页 |
| 4.2.3 质粒DNA的提取及转化 | 第73页 |
| 4.2.4 DNA片段的酶切与连接 | 第73页 |
| 4.2.5 DNA片段的合成与测定 | 第73页 |
| 4.2.6 启动子的筛选 | 第73-74页 |
| 4.2.7 重组sldAB和gcd基因表达质粒的构建 | 第74-75页 |
| 4.2.8 sldAB和gcd基因重组菌的获得 | 第75页 |
| 4.2.9 膜组分的制备及蛋白浓度的测定 | 第75页 |
| 4.2.10 工程菌酶活的计算 | 第75页 |
| 4.2.11 产5-KGA工程菌的培养条件 | 第75-76页 |
| 4.2.12 分析检测方法 | 第76页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第76-84页 |
| 4.3.1 启动子筛选 | 第76-77页 |
| 4.3.2 酶活的测定 | 第77-78页 |
| 4.3.3 工程菌的放大培养 | 第78-82页 |
| 4.3.4 外源补加辅酶PQQ | 第82-84页 |
| 4.4 小结 | 第84-86页 |
| 第五章 辅酶PQQ合成途径及呼吸链的改造 | 第86-102页 |
| 5.1 引言 | 第86-88页 |
| 5.2 材料与方法 | 第88-93页 |
| 5.2.1 菌株和质粒 | 第88页 |
| 5.2.2 主要工具酶 | 第88页 |
| 5.2.3 质粒DNA的提取及转化 | 第88-89页 |
| 5.2.4 DNA片段的酶切与连接 | 第89页 |
| 5.2.5 DNA片段的合成与测定 | 第89页 |
| 5.2.6 基因组模板的提取 | 第89页 |
| 5.2.7 PCR扩增 | 第89页 |
| 5.2.8 穿梭表达质粒pUCpr的构建 | 第89-90页 |
| 5.2.9 pqqABCDE基因簇表达质粒的构建及重组菌的获得 | 第90-92页 |
| 5.2.10 cyoBACD基因簇表达质粒的构建及重组菌的获得 | 第92页 |
| 5.2.11 PQQ浓度的测定 | 第92-93页 |
| 5.2.12 H~+/O比及呼吸链末端醌醇氧化酶活力测定 | 第93页 |
| 5.2.13 工程菌扩大培养 | 第93页 |
| 5.2.14 OTR、CTR及RQ的测定 | 第93页 |
| 5.2.15 分析检测方法 | 第93页 |
| 5.3 结果与讨论 | 第93-100页 |
| 5.3.1 PQQ合成基因的表达 | 第93-96页 |
| 5.3.2 呼吸链电子传递途径改造 | 第96-98页 |
| 5.3.3 工程菌呼吸熵RQ | 第98-99页 |
| 5.3.4 工程菌H~+/O比及醌醇氧化酶活力 | 第99-100页 |
| 5.4 小结 | 第100-102页 |
| 第六章 工程菌产5-KGA的过程控制和补料发酵 | 第102-116页 |
| 6.1 引言 | 第102-103页 |
| 6.2 材料与方法 | 第103页 |
| 6.2.1 菌株 | 第103页 |
| 6.2.2 培养基及培养条件 | 第103页 |
| 6.2.3 培养基及培养条件优化 | 第103页 |
| 6.2.4 发酵工艺调控 | 第103页 |
| 6.2.5 分析检测方法 | 第103页 |
| 6.3 结果与讨论 | 第103-115页 |
| 6.3.1 不同初糖浓度对5-KGA合成的影响 | 第103-104页 |
| 6.3.2 有机氮源对5-KGA合成的影响 | 第104-108页 |
| 6.3.3 pH对5-KGA合成的影响 | 第108-110页 |
| 6.3.4 溶氧DOT对5-KGA合成的影响 | 第110-111页 |
| 6.3.5 不同CaCO_3浓度对5-KGA合成的影响 | 第111-112页 |
| 6.3.6 流加补料方式对5-KGA合成的影响 | 第112-113页 |
| 6.3.7 Fed-batch发酵工艺确立 | 第113-115页 |
| 6.4 小结 | 第115-116页 |
| 第七章 化学催化5-KGA转化为L-(+)-酒石酸 | 第116-137页 |
| 7.1 引言 | 第116-118页 |
| 7.2 材料与方法 | 第118-120页 |
| 7.2.1 材料设备 | 第118页 |
| 7.2.2 5-KGA-K氧化反应条件 | 第118页 |
| 7.2.3 反应物的测定分析 | 第118页 |
| 7.2.4 催化剂的选择 | 第118页 |
| 7.2.5 CuSO_4·5H_2O催化剂氧化条件分析 | 第118-119页 |
| 7.2.6 H_2O_2对CuSO_4·5H_2O催化氧化的影响 | 第119页 |
| 7.2.7 Pd-C催化氧化效果分析 | 第119页 |
| 7.2.8 CuSO_4·5H_2O催化特性分析 | 第119页 |
| 7.2.9 CuSO_4·5H_2O催化机理探讨 | 第119-120页 |
| 7.3 结果与讨论 | 第120-135页 |
| 7.3.1 反应产物测定 | 第120页 |
| 7.3.2 不同过渡金属对催化的影响 | 第120-122页 |
| 7.3.3 CuSO_4·5H_2O催化条件优化 | 第122-125页 |
| 7.3.4 H_2O_2对CuSO_4·5H_2O催化氧化的影响 | 第125-126页 |
| 7.3.5 Pd-C催化氧化 | 第126-128页 |
| 7.3.6 CuSO_4·5H_2O催化氧化过程解析 | 第128-132页 |
| 7.3.7 CuSO_4·5H_2O催化5-KGA反应机理 | 第132-134页 |
| 7.3.8 CuSO_4·5H_2O物料衡算 | 第134-135页 |
| 7.4 小结 | 第135-137页 |
| 第八章 可再生资源制备L-(+)-酒石酸的工业实用性 | 第137-142页 |
| 8.1 材料与方法 | 第137-138页 |
| 8.1.1 菌株 | 第137页 |
| 8.1.2 培养基及培养条件 | 第137页 |
| 8.1.3 5-KGA钙盐的化学催化 | 第137-138页 |
| 8.1.4 分析检测方法 | 第138页 |
| 8.2 结果与讨论 | 第138-141页 |
| 8.2.1 生料发酵条件考察 | 第138页 |
| 8.2.2 5-KGA钙盐回收 | 第138-139页 |
| 8.2.3 5-KGA钙盐的化学催化 | 第139页 |
| 8.2.4 L-(+)-酒石酸生产工艺流程 | 第139-141页 |
| 8.3 小结 | 第141-142页 |
| 第九章 结论与展望 | 第142-147页 |
| 9.1 结论 | 第142-145页 |
| 9.2 创新点 | 第145页 |
| 9.3 展望 | 第145-147页 |
| 参考文献 | 第147-163页 |
| 附录 | 第163-172页 |
| 作者简历 | 第172页 |
| 在学期间所取得的科研成果 | 第172页 |
