| 摘要 | 第10-13页 |
| Abstract | 第13-16页 |
| 缩略语表(Abbreviation) | 第17-19页 |
| 第一章 文献综述 | 第19-43页 |
| 1.1 结核分枝杆菌的危害与流行 | 第19-20页 |
| 1.2 结核分枝杆菌分子生物学特征 | 第20-23页 |
| 1.2.1 Mtb理化特性 | 第20-22页 |
| 1.2.2 Mtb基因组结构 | 第22-23页 |
| 1.3 结核病的发病机制 | 第23-24页 |
| 1.4 结核病疫苗的研发 | 第24-31页 |
| 1.4.1 BCG存在问题 | 第24-25页 |
| 1.4.2 Mtb保护性抗原 | 第25-28页 |
| 1.4.2.1 Mtb分泌蛋白 | 第25-27页 |
| 1.4.2.2 Mtb非分泌蛋白 | 第27-28页 |
| 1.4.3 新型疫苗的研发 | 第28-30页 |
| 1.4.3.1 亚单位疫苗 | 第30页 |
| 1.4.3.2 全分枝杆菌疫苗 | 第30页 |
| 1.4.4 国内外结核病疫苗研究现状 | 第30-31页 |
| 1.5 结核分枝杆菌与免疫应答 | 第31-35页 |
| 1.5.1 DC的生物学特性 | 第33页 |
| 1.5.2 DC与Mtb免疫效应 | 第33-35页 |
| 1.5.2.1 DC与Mtb细胞免疫 | 第34页 |
| 1.5.2.2 DC与Mtb体液免疫 | 第34-35页 |
| 1.6 β-1,3 葡聚糖酶 | 第35-37页 |
| 1.7 蛋白质的X-射线晶体衍射学简介 | 第37-43页 |
| 1.7.1 结构生物学的简介 | 第37页 |
| 1.7.2 蛋白质结构的研究方法 | 第37-39页 |
| 1.7.2.1 冷冻电镜三维重构 | 第38页 |
| 1.7.2.2 核磁共振 | 第38-39页 |
| 1.7.2.3 X-射线衍射蛋白质晶体 | 第39页 |
| 1.7.3 X-射线衍射法测定晶体结构的基本过程 | 第39-40页 |
| 1.7.4 蛋白质的结晶 | 第40-41页 |
| 1.7.4.1 结晶常用的方法 | 第40页 |
| 1.7.4.2 影响结晶的因素 | 第40-41页 |
| 1.7.5 晶体学结构解析常用方法 | 第41-43页 |
| 1.7.5.1 单/多对同晶置换法（SIR/MIR） | 第42页 |
| 1.7.5.2 单/多波长反常散射法（SAD/MAD） | 第42页 |
| 1.7.5.3 分子置换法（MR） | 第42-43页 |
| 第二章 研究的目的、意义 | 第43-44页 |
| 第三章 材料与方法 | 第44-62页 |
| 3.1 材料 | 第44-50页 |
| 3.1.1 菌株、基因和细胞 | 第44页 |
| 3.1.2 质粒与载体 | 第44页 |
| 3.1.3 工具酶与试剂 | 第44-45页 |
| 3.1.4 培养基和抗生素的配置 | 第45-46页 |
| 3.1.5 主要缓冲液和试剂配置 | 第46-48页 |
| 3.1.5.1 琼脂糖凝胶电泳试剂 | 第46页 |
| 3.1.5.2 SDS-PAGE以及蛋白质免疫印迹（western-blot）缓冲液 | 第46-47页 |
| 3.1.5.3 蛋白表达纯化相关试剂 | 第47-48页 |
| 3.1.5.4 DNS相关试剂配置 | 第48页 |
| 3.1.6 实验动物 | 第48页 |
| 3.1.7 主要实验仪器与设备 | 第48-49页 |
| 3.1.8 实验所用引物 | 第49页 |
| 3.1.9 数据处理及分析的软件 | 第49-50页 |
| 3.2 实验方法 | 第50-62页 |
| 3.2.1 GH16家族已知结构的 β-1,3 葡聚糖酶多序列比对 | 第50页 |
| 3.2.2 基因全长克隆构建以及蛋白的表达 | 第50-53页 |
| 3.2.2.1 基因的PCR扩增 | 第50-51页 |
| 3.2.2.2 PCR产物回收与连接 | 第51页 |
| 3.2.2.3 大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法) | 第51-52页 |
| 3.2.2.4 重组质粒转化 | 第52页 |
| 3.2.2.5 重组质粒的提取与鉴定 | 第52-53页 |
| 3.2.2.6 重组质粒的诱导表达 | 第53页 |
| 3.2.3 蛋白的纯化 | 第53-55页 |
| 3.2.3.1 Ni柱亲和层析纯化 | 第53-54页 |
| 3.2.3.2 分子筛纯化 | 第54页 |
| 3.2.3.3 Western Blot分析 | 第54-55页 |
| 3.2.3.4 BCA法测量蛋白样品浓度 | 第55页 |
| 3.2.4 Rv0315结晶条件的初筛 | 第55-56页 |
| 3.2.5 晶体的优化 | 第56-57页 |
| 3.2.6 数据的采集与晶体结构的解析 | 第57-58页 |
| 3.2.6.1 蛋白晶体的数据收集 | 第57页 |
| 3.2.6.2 晶体结构解析 | 第57-58页 |
| 3.2.7 酶活性的测定 | 第58页 |
| 3.2.8 已知结构的 β-1,3 葡聚糖酶进化树的构建 | 第58页 |
| 3.2.9 4PQ9酶活性的测定 | 第58页 |
| 3.2.10 结构差异比较 | 第58-59页 |
| 3.2.11 ITC实验 | 第59页 |
| 3.2.11.1 蛋白的透析 | 第59页 |
| 3.2.11.2 结合力检测 | 第59页 |
| 3.2.12 荧光素酶实验 | 第59-60页 |
| 3.2.12.1 细胞的复苏和培养 | 第59-60页 |
| 3.2.12.2 蛋白处理与荧光素酶活性检测 | 第60页 |
| 3.2.13 流式细胞术 | 第60-62页 |
| 3.2.13.1 骨髓来源的DC细胞的分离与培养 | 第60-61页 |
| 3.2.13.2 细胞处理及表面染色 | 第61页 |
| 3.2.13.3 流式细胞术数据分析 | 第61-62页 |
| 第四章 结果与分析 | 第62-99页 |
| 4.1 RV0315蛋白序列分析 | 第62-65页 |
| 4.2 RV0315蛋白的纯化 | 第65-69页 |
| 4.2.1 蛋白的Ni纯化 | 第66-67页 |
| 4.2.2 分子筛纯化 | 第67-69页 |
| 4.3 RV0315结晶结构解析 | 第69-74页 |
| 4.3.1 Rv0315结晶条件的筛选 | 第69-71页 |
| 4.3.2 Rv0315晶体条件的优化 | 第71-72页 |
| 4.3.3 Rv0315三维结构的解析和优化 | 第72-74页 |
| 4.4 RV0315是一个没有活性的 β-1,3 葡聚糖酶 | 第74-82页 |
| 4.4.1 Rv0315突变体蛋白的纯化 | 第76-77页 |
| 4.4.2 酶水解活性的测定 | 第77-82页 |
| 4.5 发现GH16家族 β-1,3 葡聚糖酶的一个新的分支 | 第82-86页 |
| 4.6 RV0315与其他 β-1,3 葡聚糖酶结构的比较 | 第86-88页 |
| 4.7 RV0315不能识别多糖底物的分子基础 | 第88-93页 |
| 4.8 RV0315中176位的谷氨酸是其参与激活NF-κB信号通路的关键氨基酸 | 第93-95页 |
| 4.9 RV0315突变体E176S不能诱导DC细胞活化产生免疫应答 | 第95-99页 |
| 第五章 讨论 | 第99-105页 |
| 5.1 RV0315的表达与纯化 | 第99页 |
| 5.2 RV0315晶体的优化 | 第99-100页 |
| 5.3 RV0315结构与功能的关系 | 第100-105页 |
| 5.3.1 Rv0315是一个没有活性的 β-1,3 葡聚糖酶 | 第100-102页 |
| 5.3.2 GH16家族 β-1,3 葡聚糖酶一个新的进化分支 | 第102页 |
| 5.3.3 Rv0315是结核分枝杆菌一个潜在的免疫抗原 | 第102-103页 |
| 5.3.4 Rv0315在Mtb中发挥的作用 | 第103页 |
| 5.3.5 Rv0315是没有活性的 β-1,3 葡聚糖酶与其发挥免疫学作用可能的联系 | 第103-105页 |
| 结论 | 第105-106页 |
| 参考文献 | 第106-121页 |
| 附录 | 第121-123页 |
| 致谢 | 第123-125页 |
