| 中文摘要 | 第8-9页 |
| Abstract | 第9-11页 |
| 英文略语表 | 第12-14页 |
| 前言 | 第14-22页 |
| 实验材料和方法 | 第22-54页 |
| 1 实验材料 | 第22-31页 |
| 1.1 质粒 | 第22页 |
| 1.2 菌株 | 第22-23页 |
| 1.3 工具酶、酶切缓冲液及DNA Marker | 第23页 |
| 1.4 主要化学试剂 | 第23页 |
| 1.5 细胞培养用耗材 | 第23页 |
| 1.6 试剂盒 | 第23-24页 |
| 1.7 主要仪器及设备 | 第24页 |
| 1.8 主要溶液配方 | 第24-27页 |
| 1.8.1 E.coli用培养基的配制 | 第24页 |
| 1.8.2 制备感受态细胞相关溶液 | 第24-25页 |
| 1.8.3 抗生素的配制 | 第25页 |
| 1.8.4 大量提取质粒DNA的相关溶液 | 第25页 |
| 1.8.5 DNA琼脂糖凝胶电泳缓冲液及凝胶的配制 | 第25-26页 |
| 1.8.6 细胞冻存液的配制 | 第26页 |
| 1.8.7 细胞裂解液的配制 | 第26页 |
| 1.8.8 蛋白质电泳及检测缓冲液 | 第26页 |
| 1.8.9 聚丙烯酰胺凝胶电泳溶液的配制 | 第26-27页 |
| 1.8.10 常用缓冲液的配制 | 第27页 |
| 1.9 PCR引物 | 第27-28页 |
| 1.10 抗体 | 第28页 |
| 1.11 有关RNA提取以及Northern blotting溶液的配制 | 第28-29页 |
| 1.12 慢病毒小量包装 | 第29-31页 |
| 2 实验方法 | 第31-54页 |
| 2.1 单链复性 | 第31页 |
| 2.2 PCR扩增 | 第31-32页 |
| 2.3 酶切消化 | 第32-33页 |
| 2.4 连接 | 第33页 |
| 2.5 转化 | 第33页 |
| 2.6 鉴定 | 第33-34页 |
| 2.7 感受态细胞的制备 | 第34-35页 |
| 2.8 质粒DNA的小提 | 第35页 |
| 2.9 质粒DNA的大量提取 | 第35-36页 |
| 2.10 重组质粒DNA浓度的测定 | 第36页 |
| 2.11 DNA的纯化回收 | 第36-37页 |
| 2.12 贴壁细胞培养 | 第37页 |
| 2.13 稳定表达细胞株的构建 | 第37页 |
| 2.14 细胞冻存 | 第37-38页 |
| 2.15 细胞复苏 | 第38页 |
| 2.16 细胞裂解 | 第38-39页 |
| 2.17 DNA ladder分析 | 第39页 |
| 2.18 Annexin-V/PI双染流式分析测定早期细胞凋亡 | 第39页 |
| 2.19 总RNA的提取及定量 | 第39-40页 |
| 2.19.1 组织匀浆 | 第39页 |
| 2.19.2 总RNA的抽提 | 第39-40页 |
| 2.19.3 总RNA的沉淀 | 第40页 |
| 2.19.4 总RNA的洗涤和溶解 | 第40页 |
| 2.19.5 总RNA的检测 | 第40页 |
| 2.20 Northern blotting实验 | 第40-45页 |
| 2.20.1 探针的制备与纯化 | 第40-42页 |
| 2.20.2 甲醛变性电泳凝胶制备 | 第42页 |
| 2.20.3 样品处理 | 第42-43页 |
| 2.20.4 转膜 | 第43页 |
| 2.20.5 预杂交 | 第43-44页 |
| 2.20.6 杂交 | 第44页 |
| 2.20.7 洗膜 | 第44页 |
| 2.20.8 信号检测 | 第44-45页 |
| 2.20.9 探针去除及杂交参照基因Actin | 第45页 |
| 2.21 慢病毒包装实验 | 第45-46页 |
| 2.22 病毒的收获及浓缩 | 第46-48页 |
| 2.23 RNA干扰有效靶点筛选实验—RT-PCR筛靶 | 第48-51页 |
| 2.24 Annexin V/PI双染 | 第51页 |
| 2.25 Western Blotting的检测方法 | 第51-52页 |
| 2.26 蛋白提纯 | 第52-54页 |
| 结果 | 第54-95页 |
| 3.1 优化S蛋白,并合成S蛋白基因 | 第54-57页 |
| 3.2 将CD5L插入载体,构建PEAK13 CD5L Fc质粒 | 第57页 |
| 3.3 构建S及其片段基因的克隆,并检测 | 第57-58页 |
| 3.4 瞬时转染P13 CD5L S1190 Fc,检测在VeroE6细胞中的蛋白表达 | 第58-59页 |
| 3.5 SARS-CoV Spike蛋白引起细胞凋亡的形态改变 | 第59-61页 |
| 3.6 FACS检测早期凋亡的细胞 | 第61-62页 |
| 3.7 转染P13 CD5L S1190 Fc质粒诱导VeroE6细胞凋亡的DNA Ladder | 第62-63页 |
| 3.8 加入纯化的SARS-CoV 1190 Fc蛋白诱导VeroE6细胞凋亡 | 第63-64页 |
| 3.9 转染P13 CD5L S1190 Fc质粒诱导HEK293细胞的PARP剪切实验 | 第64-65页 |
| 3.10 SARS-CoV Spike蛋白的各个片段诱导凋亡的情况 | 第65-70页 |
| 3.10.1 转染SARS-CoV S各不同片段质粒剪切PARP实验 | 第65-66页 |
| 3.10.2 SARS-CoV S317 Fc不能诱导凋亡 | 第66-67页 |
| 3.10.3 SARS-CoV S318-510蛋白可以诱导凋亡 | 第67-70页 |
| 3.10.3.1 转染P13 CD5L S318-510 Fc质粒诱导的DNA Ladder | 第67-68页 |
| 3.10.3.2 加入SARS-CoV S318-510 Fc蛋白诱导的DNA Ladder | 第68-69页 |
| 3.10.3.3 FACS | 第69-70页 |
| 3.10.4 转染P13 CD5L S681-1190 Fc质粒可以诱导VeroE6细胞凋亡 | 第70页 |
| 3.11 SARS-CoV Spike蛋白凋亡早期下调Bcl-2,上调Bax | 第70-71页 |
| 3.12 SARS-CoV Spike蛋白早期抑制ERK1/2信号通路 | 第71-73页 |
| 3.12.1 转染P13 CD5L S1190 Fc质粒早期抑制ERK1/2信号通路 | 第71-73页 |
| 3.12.2 加入纯化的SARS-CoV S1190 Fc蛋白诱导VeroE6细胞ERK1/2磷酸化信号的下调 | 第73页 |
| 3.13 转染P13 CD5L S1190 Fc早期没有引起p38MAPK和JNK信号磷酸化水平的改变 | 第73-74页 |
| 3.14 转染P13 CD5L S1190 Fc质粒早期引起凋亡相关的下游重要信号分子磷酸化的改变 | 第74-75页 |
| 3.15 SARS-CoV S318-510蛋白也可以通过抑制ERK1/2信号通路诱导凋亡 | 第75-76页 |
| 3.16 STAT3上游信号JAK1,JAK2,Tyk2磷酸化水平没有改变 | 第76-78页 |
| 3.17 SARS-CoV Spike蛋白和SARS-CoV S318-510蛋白早期没有引起AKT信号改变 | 第78-79页 |
| 3.18 SARS-CoV spike蛋白可以在蛋自及mRNA水平下调ACE2的表达 | 第79-82页 |
| 3.18.1 SARS-CoV S1190 Fc蛋白引起受体ACE2下调实验 | 第79页 |
| 3.18.2 Northern blotting检测野生型C57小鼠肺脏和肾脏中ACE2的表达 | 第79-82页 |
| 3.18.2.1 小鼠肺脏和肾脏总RNA质量的检测 | 第79-81页 |
| 3.18.2.2 检测小鼠肺脏和肾脏ACE2 mRNA表达水平 | 第81页 |
| 3.18.2.3 SARS-CoV Spike蛋白下调VeroE6细胞ACE2 mRNA表达水平 | 第81-82页 |
| 3.19 构建慢病毒感染的ACE2敲除的VeroE6永久细胞株(ACE2 RNAi VeroE6) | 第82-92页 |
| 3.19.1 目的基因RNA干扰慢病毒载体制备 | 第83-84页 |
| 3.19.2 目的基因RNA干扰阳性克隆质粒抽提琼脂糖凝胶电泳图谱 | 第84-85页 |
| 3.19.3 RT-PCR检测目的基因的mRNA表达水平 | 第85-90页 |
| 3.19.4 构建慢病毒感染的ACE2 RNAi和NC RNAi的VeroE6永久细胞株 | 第90-92页 |
| 3.20 检测SARS-CoV Spike蛋白在ACE2 RNAi VeroE6和Nc RNAi VeroE6细胞凋亡中的作用 | 第92-95页 |
| 3.20.1 流式细胞仪PI单染法 | 第92-93页 |
| 3.20.2 DNA ladder法检测细胞凋亡 | 第93-95页 |
| 讨论 | 第95-102页 |
| 小结 | 第102-103页 |
| 参考文献 | 第103-110页 |
| 论文综述 | 第110-130页 |
| 参考文献 | 第123-130页 |
| 附录 | 第130-133页 |
| 致谢 | 第133-134页 |
