| 摘要 | 第1-10页 |
| ABSTRACT | 第10-12页 |
| 第一篇 文献综述 | 第12-38页 |
| 第一章 猪流感病毒的研究进展 | 第12-30页 |
| 1 猪流感病毒结构及生物学特性 | 第12-13页 |
| 2 猪流感病毒编码蛋白及功能 | 第13-19页 |
| ·凝素蛋白(Hemagglutinin,HA) | 第14-15页 |
| ·神经氨酸酶(Neuraminidase,NA) | 第15页 |
| ·聚合酶蛋白(Polymerase) | 第15-16页 |
| ·基质蛋白(Matrix,M) | 第16-17页 |
| ·核蛋白(Nucleoprotein,NP) | 第17-18页 |
| ·NS蛋白(Nonstructural protein,NS) | 第18-19页 |
| 3 猪流感病毒的复制过程 | 第19-20页 |
| 4 猪流感病毒的流行病学 | 第20-23页 |
| 5 猪流感病毒的种间传播和遗传变异 | 第23-25页 |
| ·猪流感病毒的种间传播 | 第23-25页 |
| ·猪流感病毒的遗传变异 | 第25页 |
| 6 猪流感病毒的诊断技术 | 第25-30页 |
| ·猪流感病毒分离 | 第26页 |
| ·清学检测方法 | 第26-28页 |
| ·琼脂扩散(AGID)试验 | 第26页 |
| ·血凝(HA)和血凝抑制(HI)试验 | 第26-27页 |
| ·神经氨酸酶抑制试验(NI) | 第27页 |
| ·中和试验(NT) | 第27页 |
| ·酶联免疫吸附试验(ELISA) | 第27-28页 |
| ·免疫过氧化酶单层细胞试验 | 第28页 |
| ·荧光抗体试验(immunofluorescence assay,IFA) | 第28页 |
| ·免疫组织化学试验 | 第28页 |
| ·猪流感病毒分子生物学检测 | 第28-29页 |
| ·聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR) | 第28-29页 |
| ·实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR,FQ-PCR) | 第29页 |
| ·NASBA法 | 第29页 |
| ·其它诊断方法 | 第29-30页 |
| 参考文献 | 第30-38页 |
| 第二篇 试验研究 | 第38-82页 |
| 第二章 猪流感病毒A/swine/Shanghai/1/2007株NS1、NP基因的原核表达及多克隆抗体的制备 | 第38-54页 |
| 1 材料与方法 | 第39-45页 |
| ·材料 | 第39-40页 |
| ·菌种、质粒、病毒及实验动物 | 第39页 |
| ·主要试剂 | 第39页 |
| ·主要仪器 | 第39-40页 |
| ·方法 | 第40-45页 |
| ·原核表达质粒pET-32a(+)-NS 1和pET-30a(+)-NP的构建 | 第40-41页 |
| ·引物设计与合成 | 第40页 |
| ·目的基因的PCR扩增与回收 | 第40页 |
| ·目的片段与载体的连接与转化 | 第40-41页 |
| ·阳性重组质粒的筛选 | 第41页 |
| ·重组质粒pET-32a(+)-NS1和pET-30a(+)-NP的原核表达及NS1、NP蛋白的纯化 | 第41-44页 |
| ·重组表达质粒的原核表达 | 第41页 |
| ·表达产物NS1、NP蛋白的SDS-PAGE分析 | 第41-42页 |
| ·Western blot检测重组蛋NS1、NP的表达 | 第42页 |
| ·重组蛋NS1、NP的大量表达、变性 | 第42-43页 |
| ·重组蛋白NS1、NP的纯化 | 第43-44页 |
| ·重组蛋白的复性 | 第44页 |
| ·重组蛋白浓度测定 | 第44页 |
| ·抗NS1蛋白及抗NP蛋白多克隆抗体的制备 | 第44-45页 |
| ·NS1、NP蛋白间接ELISA检测 | 第45页 |
| 2 结果 | 第45-49页 |
| ·重组表达质粒pET-32a(+)-NS1和pET-30a(+)-NP的构建 | 第45-46页 |
| ·重组质粒pET-32a(+)-NS1、pET-30a(+)-NP分别在大肠杆菌BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS中的诱导表达 | 第46-47页 |
| ·Western blot检测重组蛋白NS1、NP | 第47页 |
| ·NS1、NP蛋白纯化结果 | 第47-48页 |
| ·蛋白浓度测定 | 第48-49页 |
| ·NS1、NP蛋白间接ELISA检测 | 第49页 |
| 3 讨论 | 第49-52页 |
| 参考文献 | 第52-54页 |
| 第三章 猪流感病毒NS1蛋白间接ELISA检测方法的建立 | 第54-66页 |
| 1 材料与方法 | 第54-56页 |
| ·材料 | 第54-55页 |
| ·抗原 | 第54-55页 |
| ·血清和酶标抗体 | 第55页 |
| ·方法 | 第55-56页 |
| ·重组蛋白抗原最适包被浓度和标准血清最佳稀释度的确定 | 第55页 |
| ·确定间接ELISA检测中的各种工作条件 | 第55-56页 |
| ·标准血清作用时间的确定 | 第55页 |
| ·BL21(DE3)空诱导菌破碎液终浓度的确定 | 第55-56页 |
| ·酶标二抗作用稀释度的确定 | 第56页 |
| ·酶标二抗作用时间的确定 | 第56页 |
| ·NS1间接ELISA方法对临床样品的检测及临界值的确定 | 第56页 |
| ·NS1间接ELISA的特异性试验 | 第56页 |
| 2 结果 | 第56-62页 |
| ·重组蛋白抗原最适包被浓度和标准血清最佳稀释度的确定 | 第56-58页 |
| ·标准血清作用时间的确定 | 第58页 |
| ·BL21(DE3)空诱导菌破碎液终浓度的确定 | 第58-59页 |
| ·酶标二抗作用稀释度的确定 | 第59页 |
| ·酶标二抗作用时间的确定 | 第59-60页 |
| ·NS1间接ELISA方法对临床样品的检测及临界值的确定 | 第60-61页 |
| ·NS1间接ELISA的特异性试验 | 第61-62页 |
| ·与H3型SIV的单抗的ELISA检测 | 第61页 |
| ·与H1N2亚型SIV阳性血清的ELISA检测 | 第61-62页 |
| 3 讨论 | 第62-64页 |
| 参考文献 | 第64-66页 |
| 第四章 猪流感病毒A/swine/Shanghai/1/2007株NS1、NS、NP基因的真核表达及核定位研究 | 第66-82页 |
| 1 材料与方法 | 第67-70页 |
| ·材料 | 第67-68页 |
| ·菌种、质粒、病毒及细胞 | 第67-68页 |
| ·主要试剂 | 第68页 |
| ·主要仪器 | 第68页 |
| ·方法 | 第68-70页 |
| ·真核表达载体pEGFP-N1-NS1、pEGFP-N1-NS、pEGFP-N1-NP的构建 | 第68-69页 |
| ·引物设计与合成 | 第68页 |
| ·目的片段PCR扩增与回收,连接载体并转化,筛选阳性重组质粒 | 第68-69页 |
| ·真核表达载体pCAGGS-NS1、pCAGGS-NS、pCAGGS-NP的构建 | 第69页 |
| ·引物设计与合成 | 第69页 |
| ·目的片段PCR扩增与回收,连接载体并转化,筛选阳性重组质粒 | 第69页 |
| ·真核表达载体的表达和NS1、NS、NP蛋白的细胞定位分析 | 第69-70页 |
| 2 结果 | 第70-73页 |
| ·真核表达载体pEGFP-N1-NS1、pEGFP-N1-NS、pEGFP-N1-NP的构建 | 第70-71页 |
| ·真核表达载体pCAGGS-NS1、pCAGGS-NS、pCAGGS-NP的构建 | 第71-72页 |
| ·NS1、NS、NP蛋白在真核细胞中的表达及细胞定位分析 | 第72-73页 |
| ·真核表达载体pEGFP-N1-NS1、pEGFP-N1-NS、pEGFP-N1-NP表达产物的细胞定位分析 | 第72-73页 |
| ·真核表达载体pCAGGS-NS1、pCAGGS-NS、pCAGGS-NP表达产物的细胞定位分析 | 第73页 |
| 3 讨论 | 第73-77页 |
| 参考文献 | 第77-82页 |
| 全文总结 | 第82-84页 |
| 致谢 | 第84页 |
