| 中文摘要 | 第4-6页 |
| Abstract | 第6-7页 |
| 第一章 前言 | 第11-13页 |
| 第二章 NEDD8 突变体通过阻断neddylation酶促反应抑制CRL E3 泛素连接酶的活性 | 第13-42页 |
| 2.1 实验材料 | 第13-16页 |
| 2.1.1 细胞系 | 第13页 |
| 2.1.2 主要试剂 | 第13-14页 |
| 2.1.3 主要仪器 | 第14-15页 |
| 2.1.4 主要抗体 | 第15-16页 |
| 2.2 实验方法 | 第16-27页 |
| 2.2.1 主要试剂的配制 | 第16-19页 |
| 2.2.2 细胞培养 | 第19-20页 |
| 2.2.3 RNA提取 | 第20页 |
| 2.2.4 第一链cDNA合成 | 第20-21页 |
| 2.2.5 3XHA-NEDD8 质粒的构建 | 第21-23页 |
| 2.2.6 3XHA-NEDD8 突变体的构建 | 第23-24页 |
| 2.2.7 E1、E2、E3 和底物质粒的构建 | 第24-26页 |
| 2.2.8 PEI质粒转染 | 第26页 |
| 2.2.9 蛋白免疫印迹 | 第26页 |
| 2.2.10 免疫共沉淀 | 第26-27页 |
| 2.2.11 Strep-Tactin树脂纯化蛋白 | 第27页 |
| 2.3 实验结果 | 第27-41页 |
| 2.3.1 NEDD8 结构序列分析 | 第27-29页 |
| 2.3.2 K27R NEDD8 突变体抑制蛋白质neddylation修饰 | 第29-30页 |
| 2.3.3 K27R NEDD8 突变体未影响NEDD8 的激活过程 | 第30-32页 |
| 2.3.4 K27R NEDD8 突变体影响了NEDD8 的结合过程 | 第32-34页 |
| 2.3.5 验证UBE2M与K27R NEDD8 突变体的结合 | 第34-35页 |
| 2.3.6 验证Cul1、Cul4A与NEDD8 的表达 | 第35-36页 |
| 2.3.7 验证Cul1 和Cul4A蛋白纯化效果 | 第36页 |
| 2.3.8 K27R NEDD8 突变体抑制cullins的neddylation | 第36-37页 |
| 2.3.9 K27R NEDD8 突变体抑制cullins的泛素化修饰 | 第37-38页 |
| 2.3.10 K27R NEDD8 突变体影响了Cullin RING E3 泛素连接酶底物IkBa 的泛素化修饰 | 第38-39页 |
| 2.3.11 K27R NEDD8 突变体抑制NEDD8 酶促级联反应的可能机制 | 第39-41页 |
| 2.4 讨论 | 第41-42页 |
| 第三章 类泛素蛋白NEDD8 修饰底物鉴定 | 第42-56页 |
| 3.1 实验材料 | 第42-43页 |
| 3.1.1 细胞系 | 第42页 |
| 3.1.2 主要试剂 | 第42页 |
| 3.1.3 主要仪器 | 第42-43页 |
| 3.1.4 主要抗体 | 第43页 |
| 3.2 实验方法 | 第43-47页 |
| 3.2.1 主要试剂的配制 | 第43-45页 |
| 3.2.2 目的基因His6-NEDD8 质粒的构建 | 第45页 |
| 3.2.3 磷酸钙转染 | 第45页 |
| 3.2.4 变性条件下用TALON树脂纯化His6标签蛋白 | 第45页 |
| 3.2.5 银染 | 第45-46页 |
| 3.2.6 溶液内酶解 | 第46页 |
| 3.2.7 C18 除盐纯化 | 第46页 |
| 3.2.8 LC-MS/MS检测 | 第46-47页 |
| 3.2.9 数据分析 | 第47页 |
| 3.3 实验结果 | 第47-53页 |
| 3.3.1 验证目标蛋白纯化效率 | 第47-48页 |
| 3.3.2 验证酶解效率 | 第48页 |
| 3.3.3 质谱鉴定NEDD8 修饰蛋白的分布 | 第48-49页 |
| 3.3.4 NEDD8 修饰底物蛋白的鉴定 | 第49-51页 |
| 3.3.5 NEDD8 修饰蛋白的生物信息学分析 | 第51-53页 |
| 3.4 讨论 | 第53-56页 |
| 参考文献 | 第56-60页 |
| 综述 类泛素化修饰neddylation的功能研究进展 | 第60-69页 |
| 参考文献 | 第65-69页 |
| 攻读硕士学位期间发表论文 | 第69-70页 |
| 中英语缩略词对照表 | 第70-71页 |
| 致谢 | 第71-72页 |
