| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 符号说明 | 第11-13页 |
| 文献综述 鸡传染性法氏囊病及其诊断技术的研究现状 | 第13-21页 |
| 1. IBDV概述 | 第13-16页 |
| 1.1 病原学 | 第13页 |
| 1.2 血清学 | 第13页 |
| 1.3 分子生物学 | 第13-16页 |
| 1.3.1 IBDV基因组 | 第13-14页 |
| 1.3.2 VP1蛋白 | 第14页 |
| 1.3.3 VP2蛋白 | 第14-15页 |
| 1.3.4 VP3蛋白 | 第15页 |
| 1.3.5 VP4蛋白 | 第15-16页 |
| 1.3.6 VP5蛋白 | 第16页 |
| 2. IBD诊断技术的研究现状 | 第16-18页 |
| 2.1 免疫学诊断方法 | 第16-17页 |
| 2.1.1 琼脂扩散试验(AGP) | 第16页 |
| 2.1.2 免疫荧光技术(FAT) | 第16页 |
| 2.1.3 病毒中和试验(VNT) | 第16-17页 |
| 2.1.4 酶联免疫吸附实验(ELISA) | 第17页 |
| 2.2 分子生物学诊断方法 | 第17-18页 |
| 2.2.1 聚合酶链式反应(PCR)技术 | 第17页 |
| 2.2.2 限制性酶切片段长度多态性(RFLP) | 第17-18页 |
| 2.2.3 荧光定量PCR(real-time PCR) | 第18页 |
| 2.2.4 环介导等温扩增技术(LAMP) | 第18页 |
| 3. IBD诊断与生物标准物质 | 第18-21页 |
| 3.1 生物标准物质的概念和发展现状 | 第18-19页 |
| 3.2 兽用生物制品的意义和价值 | 第19-20页 |
| 3.3 标准物质的制备要求 | 第20-21页 |
| 研究一 鸡传染性法氏囊病病毒VP2和VP3蛋白的原核表达及抗体检测ELISA方法的建立 | 第21-48页 |
| 1. 材料 | 第21-22页 |
| 1.1 生物材料 | 第21页 |
| 1.2 主要仪器 | 第21-22页 |
| 1.3 试剂 | 第22页 |
| 2. 方法 | 第22-28页 |
| 2.1 引物的设计和目的片段的扩增 | 第22-23页 |
| 2.1.1 引物的设计 | 第22页 |
| 2.1.2 病毒基因组的提取和目的片段的扩增 | 第22-23页 |
| 2.2 VP2与VP3原核表达载体的构建 | 第23-25页 |
| 2.2.1 目的片段的回收 | 第23页 |
| 2.2.2 表达载体和目的基因的酶切及回收 | 第23-24页 |
| 2.2.3 表达载体和目的条带的连接 | 第24页 |
| 2.2.4 感受态细胞的制备及连接产物的转化 | 第24-25页 |
| 2.2.5 阳性细菌克隆的鉴定 | 第25页 |
| 2.3 重组蛋白的诱导表达和鉴定 | 第25-26页 |
| 2.3.1 重组蛋白的诱导表达 | 第25页 |
| 2.3.2 表达条件的优化 | 第25页 |
| 2.3.3 SDS-PAGE分析 | 第25页 |
| 2.3.4 Western-blot分析 | 第25-26页 |
| 2.4 重组蛋白的纯化 | 第26页 |
| 2.4.1 重组蛋白的大量表达 | 第26页 |
| 2.4.2 重组蛋白的纯化 | 第26页 |
| 2.5 鸡传染性法氏囊病病毒抗体检测ELISA方法的建立 | 第26-28页 |
| 2.5.1 抗原最佳包被浓度及待检血清最佳稀释度的优化 | 第26-27页 |
| 2.5.2 待检血清最佳孵育时间的优化 | 第27页 |
| 2.5.3 酶标二抗最佳孵育时间的优化 | 第27页 |
| 2.5.4 底物最佳显色时间及终止液的优化 | 第27页 |
| 2.5.5 抗体检测ELISA阳性临界值的确定 | 第27页 |
| 2.5.6 ELISA交叉反应性的检验 | 第27页 |
| 2.5.7 ELISA方法的批内重复性和批间重复性实验 | 第27页 |
| 2.5.8 与商品化试剂盒的检测结果比较 | 第27-28页 |
| 3. 结果 | 第28-45页 |
| 3.1 IBDV VP2和IBDV VP3目的片段的扩增效果 | 第28页 |
| 3.2 pGEX-6p-1-VP2和pGEX-6p-1-VP3原核表达载体的构建 | 第28-29页 |
| 3.3 重组蛋白的诱导表达和鉴定 | 第29-32页 |
| 3.3.1 重组蛋白的诱导表达 | 第29-30页 |
| 3.3.2 表达条件的优化 | 第30-32页 |
| 3.4 重组蛋白的纯化 | 第32-33页 |
| 3.5 鸡传染性法氏囊病病毒抗体检测ELISA方法的建立 | 第33-45页 |
| 3.5.1 抗原最佳包被浓度及待检血清最佳稀释度的优化 | 第33-35页 |
| 3.5.2 待检血清最佳孵育时间的优化 | 第35-36页 |
| 3.5.3 酶标二抗最佳孵育时间的优化 | 第36-37页 |
| 3.5.4 底物最佳显色时间及终止液的优化 | 第37-39页 |
| 3.5.5 抗体检测ELISA阳性临界值的确定 | 第39页 |
| 3.5.6 ELISA交叉反应性的检验 | 第39-40页 |
| 3.5.7 ELISA方法的批内重复性和批间重复性实验 | 第40-44页 |
| 3.5.8 与商品化试剂盒的检测结果比较 | 第44-45页 |
| 4. 小结与讨论 | 第45-48页 |
| 研究二 鸡传染性法氏囊病病毒标准抗原、标准血清的研制 | 第48-74页 |
| 1. 材料 | 第48-49页 |
| 1.1 生物材料 | 第48-49页 |
| 1.2 主要仪器 | 第49页 |
| 1.3 试剂 | 第49页 |
| 2. 方法 | 第49-57页 |
| 2.1 鸡传染性法氏囊病病毒抗原的制备、纯化与灭活 | 第49-51页 |
| 2.1.1 病毒扩增 | 第49页 |
| 2.1.2 病毒纯化 | 第49-50页 |
| 2.1.3 PCR鉴定 | 第50页 |
| 2.1.4 病毒灭活条件的优化 | 第50-51页 |
| 2.2 鸡传染性法氏囊病病毒抗原的特性分析 | 第51页 |
| 2.2.1 病毒抗原的纯粹性鉴定 | 第51页 |
| 2.2.2 琼扩效价测定 | 第51页 |
| 2.2.3 Western-blot分析 | 第51页 |
| 2.3 鸡传染性法氏囊病病毒标准抗原的标定 | 第51-52页 |
| 2.3.1 Real-time PCR测定病毒含量 | 第51-52页 |
| 2.3.2 灭活前后及冻干前后琼扩效价测定 | 第52页 |
| 2.3.3 交叉反应性鉴定 | 第52页 |
| 2.4 传染性法氏囊病病毒标准抗原的其他检验 | 第52-54页 |
| 2.4.1 标准病毒抗原的分装 | 第52页 |
| 2.4.2 物理性状的检查 | 第52-53页 |
| 2.4.3 无菌检验 | 第53页 |
| 2.4.4 支原体检验 | 第53页 |
| 2.4.5 装量差异系数分析 | 第53页 |
| 2.4.6 均一性 | 第53-54页 |
| 2.4.7 冻融稳定性 | 第54页 |
| 2.4.8 长期保存 | 第54页 |
| 2.5 鸡传染性法氏囊病病毒多抗血清的制备 | 第54页 |
| 2.6 鸡传染性法氏囊病病毒标准血清的标定 | 第54-55页 |
| 2.6.1 琼扩效价测定 | 第54页 |
| 2.6.2 交叉反应性鉴定 | 第54-55页 |
| 2.6.3 Western-blot分析 | 第55页 |
| 2.6.4 IFA效价测定 | 第55页 |
| 2.6.5 ELISA效价测定 | 第55页 |
| 2.7 鸡传染性法氏囊病病毒标准血清其他检验 | 第55-57页 |
| 2.7.1 标准血清的分装 | 第55-56页 |
| 2.7.2 物理性状的检查 | 第56页 |
| 2.7.3 无菌检验 | 第56页 |
| 2.7.4 支原体检验 | 第56页 |
| 2.7.5 装量差异系数分析 | 第56-57页 |
| 2.7.6 防腐剂前后及冻干前后效价测定 | 第57页 |
| 2.7.7 均一性 | 第57页 |
| 2.7.8 冻融稳定性 | 第57页 |
| 2.7.9 长期保存 | 第57页 |
| 3. 结果 | 第57-72页 |
| 3.1 鸡传染性法氏囊病病毒抗原的制备、纯化与灭活 | 第57-58页 |
| 3.1.1 病毒纯化 | 第57-58页 |
| 3.1.2 PCR鉴定 | 第58页 |
| 3.1.3 病毒灭活条件的优化 | 第58页 |
| 3.2 鸡传染性法氏囊病病毒抗原的特性分析 | 第58-60页 |
| 3.2.1 病毒纯粹性鉴定 | 第58-59页 |
| 3.2.2 琼扩效价测定 | 第59-60页 |
| 3.2.3 Western-blot分析 | 第60页 |
| 3.3 鸡传染性法氏囊病病毒标准抗原的标定 | 第60-62页 |
| 3.3.1 Real-time PCR测定病毒含量 | 第60-62页 |
| 3.3.2 灭活前后及冻干前后琼扩效价测定 | 第62页 |
| 3.3.3 交叉反应性鉴定 | 第62页 |
| 3.4 传染性法氏囊病病毒标准抗原的其他检验 | 第62-64页 |
| 3.4.1 物理性状的检查 | 第62页 |
| 3.4.2 无菌检验 | 第62-63页 |
| 3.4.3 支原体检验 | 第63页 |
| 3.4.4 装量差异系数分析 | 第63页 |
| 3.4.5 均一性 | 第63-64页 |
| 3.4.6 冻融稳定性 | 第64页 |
| 3.4.7 长期保存 | 第64页 |
| 3.5 鸡传染性法氏囊病病毒标准血清的标定 | 第64-69页 |
| 3.5.1 琼扩效价测定 | 第64-65页 |
| 3.5.2 交叉反应性鉴定 | 第65-67页 |
| 3.5.3 Western-blot分析 | 第67-68页 |
| 3.5.4 IFA效价分析 | 第68-69页 |
| 3.5.5 ELISA效价测定 | 第69页 |
| 3.6 鸡传染性法氏囊病病毒标准血清的其他检验 | 第69-72页 |
| 3.6.1 物理性状的检查 | 第69页 |
| 3.6.2 无菌检验 | 第69-70页 |
| 3.6.3 支原体检验 | 第70页 |
| 3.6.4 装量差异系数分析 | 第70页 |
| 3.6.5 防腐剂添加前后及冻干前后效价测定 | 第70页 |
| 3.6.6 均一性 | 第70-71页 |
| 3.6.7 冻融稳定性 | 第71页 |
| 3.6.8 长期保存 | 第71-72页 |
| 4. 讨论与小结 | 第72-74页 |
| 全文总结 | 第74-75页 |
| 参考文献 | 第75-79页 |
| 致谢 | 第79-80页 |
