| 摘要 | 第1-8页 |
| Abstract | 第8-10页 |
| 缩略语表 | 第10-11页 |
| 1. 前言 | 第11-23页 |
| ·氨基葡萄糖简介及应用 | 第11-12页 |
| ·氨基葡萄糖简介 | 第11页 |
| ·氨基葡萄糖在生物医药领域的应用 | 第11-12页 |
| ·氨基葡萄糖在食品领域的应用 | 第12页 |
| ·氨基葡萄糖的制备方法 | 第12-15页 |
| ·化学合成法 | 第12页 |
| ·酸水解法 | 第12-13页 |
| ·微生物发酵法 | 第13-15页 |
| ·生物酶转化法 | 第15页 |
| ·NAGPase | 第15-19页 |
| ·NAGPase概述 | 第15-16页 |
| ·NAGPase的结构特征 | 第16-17页 |
| ·NAGPase的催化机制 | 第17-18页 |
| ·NAGPase的酶活测定 | 第18-19页 |
| ·蛋白质的定向进化 | 第19-21页 |
| ·随机突变 | 第20页 |
| ·定点突变 | 第20-21页 |
| ·本研究的目的和意义 | 第21-22页 |
| ·技术路线 | 第22-23页 |
| 2. 材料与方法 | 第23-42页 |
| ·材料 | 第23-26页 |
| ·菌株与质粒 | 第23页 |
| ·试剂 | 第23页 |
| ·培养基 | 第23-24页 |
| ·溶液 | 第24-26页 |
| ·设备仪器 | 第26页 |
| ·N-乙酰氨基葡萄糖6磷酸脱乙酰酶基因（nagA）的获得方法 | 第26-31页 |
| ·N-乙酰氨基葡萄糖6磷酸脱乙酰酶天然菌株的筛选 | 第26-27页 |
| ·筛选菌株的菌种鉴定 | 第27页 |
| ·阪崎肠杆菌C. sakazakii基因组总DNA的抽提 | 第27-28页 |
| ·克隆CsnagA基因和EcnagA基因 | 第28-29页 |
| ·PCR产物的纯化、回收和酶切 | 第29页 |
| ·碱裂解法抽提大肠杆菌的pGEX-6p-1 质粒 | 第29-30页 |
| ·载体pGEX-6p-1 的制备 | 第30页 |
| ·酶连 | 第30页 |
| ·E. coli电转感受态细胞的制备 | 第30-31页 |
| ·电转化 | 第31页 |
| ·阳性克隆子的检测 | 第31页 |
| ·CsNAGPase和EcNAGPase的表达与纯化 | 第31-34页 |
| ·CsNAGPase和Ec NAGPase的诱导表达 | 第31-32页 |
| ·蛋白SDS-PAGE的检测 | 第32-33页 |
| ·CsNAGPase和Ec NAGPase的纯化 | 第33-34页 |
| ·蛋白浓度的测定 | 第34页 |
| ·NAGPase的酶学性质研究 | 第34-38页 |
| ·标准曲线的绘制 | 第34-36页 |
| ·CsNAGPase和Ec NAGPase的酶活测定方法 | 第36页 |
| ·CsNAGPase和Ec NAGPase的最适反应温度测定 | 第36-37页 |
| ·CsNAGPase的热稳定性测定 | 第37页 |
| ·CsNAGPase和Ec NAGPase的最适pH测定 | 第37-38页 |
| ·CsNAGPase的pH稳定性 | 第38页 |
| ·金属离子和化合物对CsNAGPase的影响 | 第38页 |
| ·RP-HPLC测定CsNAGPase和Ec NAGPase的转化率 | 第38页 |
| ·CsNAGPase对产物乙酸和pH 4.0 缓冲液的耐受性 | 第38页 |
| ·CsnagA基因随机突变库的构建 | 第38-42页 |
| ·易错PCR扩增基因CsnagA | 第38-39页 |
| ·易错PCR产物的纯化、酶切和回收 | 第39页 |
| ·酶连 | 第39页 |
| ·电转化 | 第39-40页 |
| ·文库质量检测 | 第40页 |
| ·随机突变文库的筛选 | 第40页 |
| ·突变蛋白的诱导表达和纯化 | 第40-41页 |
| ·突变菌株的基本酶学性质测定 | 第41页 |
| ·突变菌株的酶动力学常数测定 | 第41页 |
| ·RP-HPLC测定突变菌株的转化率测定 | 第41页 |
| ·酶的三维结构模拟和分析 | 第41-42页 |
| 3. 结果分析 | 第42-71页 |
| ·NAGPase天然菌株的筛选 | 第42-43页 |
| ·阪崎肠杆菌C. sakazakii基因组DNA的提取 | 第43-44页 |
| ·PCR扩增CsnagA基因和EcnagA基因 | 第44-45页 |
| ·重组质粒pGEX-6p-CsnagA和pGEX-6p-EcnagA的构建 | 第45-47页 |
| ·CsnagA基因及其蛋白序列分析 | 第47-49页 |
| ·CsNAGPase和EcNAGPase蛋白的表达和纯化 | 第49-50页 |
| ·CsNAGPase的酶学性质的分析 | 第50-59页 |
| ·氨基葡萄糖标准曲线的绘制 | 第50-52页 |
| ·酶的最适pH和pH耐受性 | 第52-54页 |
| ·酶的最适反应温度和温度耐受性 | 第54-56页 |
| ·金属离子和化合物对CsNAGPase活性的影响 | 第56页 |
| ·CsNAGPase和Ec NAGPase的动力学参数测定 | 第56-58页 |
| ·CsNAGPase和Ec NAGPase的转化率 | 第58-59页 |
| ·CsnagA基因随机突变库的构建 | 第59-71页 |
| ·易错PCR法扩增CsnagA基因 | 第59-60页 |
| ·随机突变体库重组质粒的检测 | 第60-61页 |
| ·突变体库突变频率的分析 | 第61-62页 |
| ·耐酸性提高突变株的筛选 | 第62-63页 |
| ·突变型酶的诱导表达 | 第63-65页 |
| ·突变体 1-B2的酶学性质分析 | 第65-71页 |
| 4. 讨论 | 第71-75页 |
| ·CsNAGPase的酶学性质分析 | 第71页 |
| ·CsNAGPase的随机突变 | 第71-74页 |
| ·工作展望 | 第74-75页 |
| 参考文献 | 第75-84页 |
| 附录 | 第84-85页 |
| 致谢 | 第85页 |
